白術提取物蒼術酮對脂多糖誘導的BV2細胞神經炎性影響及相關機制研究

李 靜，金倫喆，金洪光

1九江學院附屬醫院藥劑科，九江 332000；2韓國圓光大學藥學院，益山 54641；3九江學院，九江 332000

炎癥是免疫防御反應中的重要環節，也是臨床中最常見的病癥之一。多數疾病的發生、發展過程中都伴隨有炎癥反應[1]。炎癥反應與許多慢性疾病如關節炎、骨質疏松、哮喘、阿爾茨海默病、心血管疾病、癡呆、癌癥、肥胖及Ⅱ型糖尿病等密切相關[2]。小膠質細胞在中樞神經系統內分布廣泛，是中樞神經系統的主要免疫細胞，在維持中樞神經系統穩態和損傷修復過程中發揮重要作用。小膠質細胞介導的炎癥反應在腦缺血、神經退行性疾病等疾病的發生發展過程中起關鍵作用[3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可誘導小膠質細胞表型發生改變并釋放一系列致炎性因子如一氧化氮(NO)，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，前列腺素E2(PGE2)，白介素類(ILs)，腫瘤壞死因子(TNF-α)，環氧合酶-2(COX-2)等，引起炎癥反應和組織損傷[4]。

白術根莖具有利尿、抗炎、抗腫瘤、抗衰老、止痛、調節免疫、降血糖以及抑制代謝活化酶等作用[5]。蒼術酮是白術主要提取物之一，已有研究表明蒼術酮對于LPS誘導的RAW264.7有顯著抗炎活性作用[6-8]。但是蒼術酮對于神經炎性反應影響及其機制尚無研究報道。

本研究以LPS誘導小鼠小膠質細胞BV2建立細胞炎癥模型，研究蒼術酮預處理對神經炎癥相關因子表達的影響并探索其相關信號通路。

1 材料及方法

1.1 藥材及試劑

白術藥材(根莖生品，韓國)；BV2細胞(韓國圓光大學藥學院)；ELISA試劑盒(R&D systems，美國)；anti- iNOS、COX-2、MAPK、NF-κB抗體(Cell Signaling Tecnology，美國)；二抗(Santa Cruz Biotechnology，德國)。

1.2 蒼術酮的制備及結構鑒定

取干燥白術根莖(生品)切片2.00 kg，甲醇回流提取2 h，共3次，合并提取液，濃縮后得總浸膏。浸膏加適量蒸餾水分散后，用正己烷萃取回收溶劑后得正己烷萃取物(8.95 g)。再經硅膠柱色譜分離，以正己烷、正己烷-乙酸乙酯、氯仿-甲醇梯度洗脫，得到Fr.H.1～Fr.H.7共7個組分。組分Fr.H.1經Sephadex LH-20柱色譜分離，以正己烷洗脫，得到Fr.H.1.1～Fr.H.1.6共6個組分。組分Fr.H.1.1經硅膠柱色譜分離，以正己烷洗脫，得蒼術酮。結構經NMR法進行鑒定。

1.3 細胞存活率檢測(MTT法)

BV2細胞于含有10%胎牛血清的RMPI培養液、37 ℃、5% CO2條件下培養。將BV2細胞種植于96孔板，待細胞貼壁后，加入蒼術酮終濃度為2.5、5、10、20、40、80、160和320 μM，每組6孔，孵育24 h。細胞處理結束后，加入終濃度0.5 mg/mL MTT溶液，于37 ℃、5% CO2條件下繼續培養3 h，吸除上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶液(DMSO)，室溫振蕩15 min，于590 nm處檢測吸光度值。

1.4 細胞上清液NO及PGE2、IL-6、TNF-α水平檢測

調整細胞懸液為1×105/mL，加入24孔培養板內，待細胞貼壁后，加入蒼術酮終濃度為10、20、40和80 μM，對照組加入等體積RMPI培養基，每個樣品重復三次，培養3 h后，除對照組外均加入LPS終濃度為1 μg/mL，繼續培養24 h后取上清液。Griess法檢測NO濃度，上清液加入同體積Griess reagent A及Griess reagent B 1∶1混合溶液，混勻后于540 nm處測定吸光度，根據所測結果繪制標準曲線，計算樣品NO濃度。ELISA法檢測上清液中PGE2、IL-6、TNF-α含量，按照ELISA檢測試劑盒說明書分別檢測，根據標準曲線計算樣本中炎癥因子水平。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達

1.5.1 COX-2、iNOS總蛋白提取方法

調整細胞懸液為1×106/mL，加入6孔培養板內，待細胞貼壁后，加入蒼術酮終濃度為10、20、40和80 μM，對照組加入等體積RMPI培養基，培養3 h后，除對照組外加入LPS終濃度為1 μg/mL，繼續培養24 h后提取蛋白，提取液為細胞裂解液。

1.5.2 MAPK、NFκB總蛋白提取方法

調整細胞懸液為1×106/mL，加入6孔培養板內，待細胞貼壁后，加入蒼術酮終濃度為10、20、40和80 μM，對照組加入等體積RMPI培養基，培養3 h后，除對照組外加入LPS終濃度為1 μg/mL，繼續培養30 min后提取蛋白，提取液為裂解液與磷酸酶抑制劑混合液比率為100∶3。

1.5.3 蛋白檢測

總蛋白上樣，應用7.5%或12%SDS-PAGE濃縮膠及分離膠進行垂直電泳，45V恒流90 min轉膜，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，4℃條件下與一抗溶液孵育過夜，含0.05% Tween-20 TBS溶液洗膜3次，加入二抗溶液于室溫條件下孵育1 h，洗滌后ECL顯色。

1.6 統計學處理

2 實驗結果

2.1 蒼術酮結構鑒定

1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.06(1H，s，H-12)，4.88(1H，d，J=1.6 Hz，H-15b)，4.72(1H，d，J=1.6 Hz，H-15a)，2.38～2.44(4H，m，H-3β，6α，9α，9β)，2.31(1H，t，J=13.2 Hz，H-6β)，2.11(1H，dd，J=11.0，5.0 Hz，H-5α)，2.05(1H，td，J=13.2，4.0 Hz，H-3α)，1.97(3H，s，H-13)，1.62～1.72(2H，m，H-1β，2α)，1.57(1H，tt，J=13.2，3.6 Hz，H-2β)，1.52(1H，td，J=12.4，3.6 Hz，H-1α)，0.78(3H，s，H-14)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：149.9(C-4)，149.5(C-8)，137.0(C-12)，119.6(C-7)，116.2(C-11)，107.4(C-15)，45.8(C-5)，42.0(C-1)，39.4(C-9)，37.4(C-3)，36.7(C-10)，23.7(C-2)，21.0(C-6)，17.6(C-14)，8.3(C-13)。

2.2 蒼術酮對BV2細胞存活率的影響

正常對照組與蒼術酮2.5～80 μM藥物組之間細胞存活率無顯著差異，160和320 μM藥物組細胞存活率顯著下降(P<0.001)。表明蒼術酮2.5～80 μM對BV2細胞生長狀態無顯著影響。結果見圖1。

圖1 蒼術酮對BV2細胞存活率的影響Fig.1 Effect of AT on cell viability注：蒼術酮給藥組與正常對照組比較，***P<0.001。Note:AT group vs control group,***P<0.001.

2.3 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞NO水平及iNOS蛋白表達的影響

與正常對照組相比，LPS模型組細胞上清液中的NO含量顯著增加(P<0.001)；與模型組比較，蒼術酮預處理后顯著降低細胞上清液中NO水平(P<0.01，P<0.001)。表明蒼術酮可有效抑制炎癥因子NO的釋放。同時，與正常對照組比較，LPS組iNOS蛋白表達明顯增高，蒼術酮預處理后明顯降低。結果見圖2和3。

圖2 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞NO含量的影響Fig.2 Effect of AT on Nitrite level of LPS-induced注：LPS模型組與正常對照組比較，#P<0.001；給藥組與模型組比較，**P<0.01，***P<0.001。Note:LPS group vs control group,#P<0.001;AT group vs LPS model group,**P<0.01,***P<0.001.

圖3 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞iNOS蛋白表達的影響Fig.3 Effect of AT on iNOS expression of LPS-induced BV2 cells

2.4 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞上清液PGE2水平及COX-2蛋白表達的影響

與正常對照組比較，LPS模型組細胞上清PGE2含量顯著增高(P<0.001)；與LPS模型組比較，蒼術酮預處理后均顯著降低細胞上清中PGE2水平(P<0.001)。同時，與正常對照組比較，LPS組COX-2蛋白表達明顯增高，蒼術酮預處理后明顯降低。結果見圖4和5。

圖4 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞PGE2水平的影響Fig.4 Effect of AT on PGE2 level of注：LPS模型組與正常對照組比較，#P<0.001；給藥組與模型組比較，***P<0.001。Note:LPS group vs control group,#P<0.001;AT group vs LPS model group, ***P<0.001.

圖5 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞COX-2蛋白表達的影響Fig.5 Effect of AT on COX-2 expression of LPS-induced BV2 cells

2.5 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞上清液IL-6水平的影響

與正常對照組比較，LPS模型組細胞上清液IL-6水平顯著增高(P<0.001)；與LPS模型組比較，蒼術酮預處理后顯著降低細胞上清液中IL-6水平(P<0.05，P<0.001)，表明蒼術酮可有效抑制LPS誘導BV2細胞IL-6釋放。結果見圖6。

圖6 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞IL-6水平的影響Fig.6 Effect of AT on IL-6 level of LPS-induced注：LPS模型組與正常對照組比較，#P<0.001；給藥組與模型組比較，*P<0.05，***P<0.001。Note:LPS group vs control group,#P<0.001;AT group vs LPS model group,*P<0.05, ***P<0.001.

2.6 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞上清液TNF-α水平的影響

與正常對照組比較，LPS模型組細胞上清液TNF-α水平顯著增高(P<0.001)。與LPS模型組比較，蒼術酮預處理后均顯著降低細胞上清液中TNF-α水平(P<0.001)，表明蒼術酮可有效抑制LPS誘導BV2細胞TNF-α釋放。結果見圖7。

圖7 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞TNF-α水平的影響Fig.7 Effect of AT on TNF-α level of LPS-induced注：LPS模型組與正常對照組比較，#P<0.001；給藥組與模型組比較，***P<0.001。Note:LPS group vs control group,#P<0.001;AT group vs LPS model group,***P<0.001.

2.7 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞蛋白MAPK表達的影響

與正常對照組比較，LPS組ERK、JNK、p38磷酸化蛋白表達均明顯增高，蒼術酮預處理后，可明顯降低JNK磷酸化蛋白表達，可明顯降低ERK磷酸化蛋白表達。然而對p38磷酸化蛋白表達無明顯影響。結果見圖8。

圖8 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞MAPK蛋白表達的影響Fig.8 Effect of AT on MAPK expression in LPS-induced BV2 cells

2.8 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞蛋白NF-κB蛋白表達的影響

與正常對照組比較，LPS組細胞質和細胞核總p65磷酸化蛋白，IκB-α磷酸化蛋白表達均明顯增高，IκB-α蛋白表達明顯降低。蒼術酮預處理后可明顯降低總p65，IκB-α磷酸化蛋白表達，同時增加IκB-α總蛋白表達。結果見圖9和10。

圖9 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞NF-κB蛋白表達的影響Fig.9 Effect of AT on NF-κB expression in LPS-induced BV2 cells

圖10 蒼術酮對LPS誘導BV2細胞NF-κB蛋白表達的影響Fig.10 Effect of AT on NF-κB expression in LPS-induced BV2 cells

3 結論

來研究發現白術及其提取物有明顯的抗炎作用。一些研究表明白術提取物白術內酯具有抗阿爾默茨海默癥、帕金森病以及神經保護作用[9,10]。蒼術酮作為白術揮發油中主要物質之一，最早和白術內酯一起被發現有抗炎作用[11]。多個研究報道中，蒼術酮對于LPS誘導的RAW264.7有顯著抗炎作用[6-8]。但是蒼術酮對于神經炎性反應影響及其機制尚無研究報道。

小膠質細胞是中樞神經系統的主要免疫細胞，受到異常如LPS等刺激后會產生一系列致炎因子，進而發展為神經炎性及神經退化性疾病。炎癥因子是炎癥反應中重要的細胞活性因子，它們對細胞炎癥都有直接或間接的作用，彼此之間也產生影響[12]。在神經炎性反應中，產生的致炎因子包括一氧化氮(NO)，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，環氧合酶-2(COX-2)，前列腺素E2(PGE2)，白介素類(ILs，如IL-6)，腫瘤壞死因子(TNF-α)等。iNOS是NO合成酶，它的表達直接決定NO分泌量，是炎癥反應檢測的一個重要指標[13]。COX可以催化花生四烯酸生成前列腺素H2(PGH2)，而PGH2是前列腺素的前體。COX有三種類型的同工酶，其中COX-2與炎癥的關系最為密切[14]。本實驗結果表明，LPS誘導BV2細胞上清液中NO、PGE2、IL-6和TNF-α炎癥因子表達和細胞中iNOS、COX-2蛋白表達顯著增加。而蒼術酮預處理能夠劑量依賴性分別減少NO、PGE2的生成及減少iNOS、COX-2蛋白表達，以及抑制炎癥因子IL-6和TNF-α的釋放，此結果表明蒼術酮對細胞炎癥反應具有顯著抑制作用。

LPS觸發NF-κB和MAPK通路。NF-κB是一種控制DNA轉錄的蛋白復合體，在炎癥及免疫反應中起著關鍵作用，包括調控致炎因子iNOS和COX-2基因的表達[15]。正常條件下NF-κB復合體位于細胞質中，由kB-α(IkB-α)和p50/p65組成，被激活后IkBa磷酸化并降解，于是NF-kB從細胞質NF-kB/IkBa復合物中釋放出來，NF-kB p65亞單位上的S536發生磷酸化的反應，從而使游離狀態的NF-kB進入細胞核中，與靶向的DNA進行結合，促進炎癥因子IL-6、TNF-α等的大量表達[16]。該實驗LPS刺激后BV2細胞包括細胞質和細胞核中總p65磷酸化蛋白表達增加，細胞質中IkB-α磷酸化蛋白表達增加同時IkB-α降解增加，而蒼術酮可抑制此兩者磷酸化表達同時減少IkB-α降解。結果表明蒼術酮可通過NF-κB通路抑制炎癥的發生。

MAPK通路是從細胞表面傳導到細胞核內部的重要傳遞者，是細胞增殖、應激、炎癥、凋亡等信號轉導通路的共同交匯通路之一，主要亞族包括ERK、p38和JNK[17]。在刺激條件下MAPK通路蛋白磷酸化，并激活NF-kB通路，另外MAPK通路也可通過調節其他轉錄因子如CREB、AP-1、Elk-1等發生炎癥反應[18]。本實驗中LPS組ERK、JNK和p38磷酸化蛋白表達均明顯增高，蒼術酮可明顯降低JNK和ERK磷酸化蛋白表達，然而對p38磷酸化蛋白表達無明顯影響。表明蒼術酮可通過ERK、JNK通路抑制炎癥的發生。

蒼術酮可顯著預防及抑制細胞炎癥反應，其機制與炎癥通路ERK、JNK和NF-κB有關。未來將基于TLR4/MyD88 /Nf-κB炎癥通路進行深入研究。