太子參參須提取物對免疫抑制小鼠免疫保護作用的研究

衣偉萌，陳賽紅，閔思明，陳俊宇，甘思言，黃一帆，張炎達，馬玉芳*

1中西獸醫(yī)結(jié)合與動物保健福建省高等學校重點實驗室；2福建農(nóng)林大學 福建省獸醫(yī)中藥與動物保健重點實驗室，福州 350002；3福建貝迪藥業(yè)有限公司，寧德 355399

太子參又名孩兒參、童參、四葉參或米參，來源于石竹科太子參屬多年草本根性植物異葉假繁縷的干燥塊根，是臨床常用的補益中藥[1]。太子參味甘、微苦而性平，偏微寒，既能益氣，又可養(yǎng)陰生津，且藥力平和，是一味清補之藥，適用于脾肺虧虛、氣陰不足、氣津不足諸癥[2]。目前已被分離出多糖、皂苷、環(huán)肽等多種生物活性成分[3]。研究表明，太子參提取物能增強機體免疫力，拮抗環(huán)磷酰胺(CY)造成的免疫抑制[4]。太子參須化學成分與太子參成分相似，研究表明太子參參須中多糖含量和皂苷含量達18.79%和0.22%[5]。Wu等[6]研究表明太子參參須能夠增加血液中白細胞數(shù)，提高豬瘟抗體水平并延長作用時間，從而增強仔豬免疫能力。目前關(guān)于太子參參須提取物對免疫抑制小鼠免疫功能的研究鮮見報道。本試驗先給小鼠灌胃太子參參須提取物(RPFRE)2周后，再腹腔注射CY，通過檢測小鼠的免疫器官指數(shù)、脾淋巴細胞增殖、巨噬細胞吞噬功能、血清細胞因子含量等指標以及血清免疫球蛋白、補體含量的變化，探討RPFRE對免疫抑制小鼠的免疫保護作用，為RPFRE的臨床推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)和數(shù)據(jù)借鑒。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 太子參參須提取物

太子參參須提取物由福建貝迪藥業(yè)有限公司提供，該產(chǎn)品主要成為多糖和皂苷。陽性對照藥物黃芪多糖(APS)，由北京愛迪森生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 試驗動物

清潔級KM小鼠，雄性，3～4周齡，20±2 g，購于福建醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.3 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清(CellMax公司)；Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(上海源培生物科技有限公司)；刀豆蛋白(ConA)，脂多糖(LPS)(美國Sigma公司)；碳酸鈉(國藥集團)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國Merck公司)；二甲基亞砜(DMSO)(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司)；印度墨汁(上海源葉生物科技有限公司)；免疫球蛋白試劑盒、補體試劑盒(浙江伊利康生物技術(shù)有限公司)；注射用CY(上海Baxter 公司)；氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)。

1.1.4 主要儀器

獨立送回風凈化籠具(IVC)(蘇州市蘇杭科技器材有限公司)；X-22R臺式高速冷凍離心機(美國Beckman公司)；Milli-Q Direct8/16超純水系統(tǒng)(美國Merck Millipore公司)；SE202F型電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；AL104微量電子天平(上海梅特勒—托利多儀器有限公司)；V-1200可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；RT - 9900半自動生化分析儀(雷杜生命科學股份有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；SW-CJ-2G雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Infinite M200 Pro多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-RAD，美國伯樂公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及處理

120只KM小鼠，隨機分為對照(CK)組、模型(CY)組、黃芪多糖(APS)組、RPFRE高、中、低劑量組，共6組，每組20只。第1～14天，CK和CY小鼠灌胃雙蒸水，RPFRE高、中、低劑量組(H-RPFRE組、M-RPFRE組、L-RPFRE組)小鼠分別灌胃太子參參須提取物400、200、100 mg/kg，APS組小鼠灌胃200 mg/kg APS；第15天起，CK組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余五組小鼠腹腔注射80 mg/kg BW環(huán)磷酰胺，連續(xù)給藥3天。第18天，每組小鼠5只用于碳粒廓清法測定小鼠吞噬功能；5只用于MTT法測定脾T和B淋巴細胞增殖；剩余小鼠正常采樣。

1.2.2 體重

試驗開始后，每兩天稱重1次，觀察試驗過程中小鼠的體重變化和生長狀態(tài)。

1.2.3 血樣采集與處理

小鼠摘眼球采血，3 000 rpm，離心10 min，收集血清，分裝于Eppendorf 管，-20 ℃保存。

1.2.4 免疫器官指數(shù)的測定

試驗第18天，小鼠稱重，頸椎脫臼法處死，取脾臟、胸腺、肝臟，稱量，計算上述器官指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/體重(g)。

1.2.5 巨噬細胞吞噬功能的測定

巨噬細胞吞噬指數(shù)的測定參見文獻[7]。小鼠尾靜脈注射印度墨汁(0.1 mL/10g)，分別于注射后第2 min(T2)和10 min(T10)眼底靜脈叢取血20 μL，加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，充分吹打混勻，測定600 nm波長處吸光度(OD值)，以O(shè)D2、OD10分別表示T2和T10時的吸光值。計算廓清指數(shù)K吞噬指數(shù)α，公式如下：

1.2.6 小鼠脾T和B淋巴細胞增殖

1.2.6.1 制備脾淋巴細胞懸液

脾淋巴細胞的制備參見文獻[8]。試驗組各取5只小鼠，頸椎脫臼法處死，無菌取脾，置于滅菌的研缽中，磨碎脾臟，加入Hank’s液3.75 mL，混勻，過濾，制成單個脾細胞懸液，以Hank’s液洗滌3次，1 500 rpm離心5 min。加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640(完全培養(yǎng)液)2 mL，渦旋混勻，計數(shù)，調(diào)整至7.5×106個/mL的細胞稀釋液，供脾細胞增殖用。

1.2.6.2 脾淋巴細胞增殖的測定

取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL上述脾細胞懸液，空白孔加100 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)液，試驗孔分別加100 μL ConA(終濃度為5 μg/mL)和100 μL LPS(終濃度為10 μg/mL)，每只小鼠設(shè)4復(fù)孔。置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h后，每孔加入50 μLMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 000 rpm，離心5 min，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，低速震蕩5min，在波長為570 nm的酶標儀處讀數(shù)，以空白對照孔調(diào)零。計算方法參照參考文獻[9]。計算刺激指數(shù)SI，公式如下：

刺激指數(shù)(SI)=試驗孔OD值/空白孔OD值

1.2.7 血清細胞因子含量的測定

將1.2.3收集到的血清，以ELISA法按照血清細胞因子IL-2、血清細胞因子IL-4、血清細胞因子IL-6 以及血清細胞因子IFN-γ 試劑盒說明，用酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-RAD，美國伯樂公司)檢測，記錄每個樣品在相應(yīng)波長下的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算各細胞因子含量。

1.2.8 血清中免疫球蛋白、補體含量的測定

將1.2.3分裝的血清，以免疫比濁法按照血清免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)、補體(C3和C4)的試劑盒的說明檢測，按說明對樣品進行處理，后借RT-9900半自動生化分析儀檢測各樣品抗原-抗體復(fù)合物的濁度，通過與同樣處理的校準液比較，計算各樣品的免疫球蛋白和補體含量，具體處理步驟見試劑盒說明書。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗小鼠體重變化

試驗小鼠體重變化見表1。由表1可知：與CK組相比，CY組小鼠末重顯著低于CK組小鼠(P<0.01)，增重較CK組差異極顯著(P<0.01)。與CY組相比，RPFRE各劑量組小鼠末重均高于CY組，但差異不顯著(P>0.05)，其中RPFRE高劑量組和APS組小鼠增重明顯(P<0.05)。

2.2 RPFRE對免疫抑制小鼠器官指數(shù)的影響

RPFRE對免疫抑制小鼠器官指數(shù)的影響如表2所示。與CK相比，CY小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)以及肝指數(shù)都明顯降低，且差異極顯著(P<0.01)；與CY小鼠相比，RPFRE高劑量組小鼠的脾臟指數(shù)、肝指數(shù)極顯著升高(P<0.01)；RPFRE低、中劑量組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、肝指數(shù)也有升高，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 RPFRE對免疫抑制小鼠體重的影響(mg/g)Table 1 Effect of RPFRE on weight of immunosuppressed mice (mg/g)

注：a與CK組相比，差異顯著(P<0.05);A與CK組相比，差異極顯著(P<0.01)；b與CY組相比，差異顯著(P<0.05);B與CY組相比，差異極顯著(P<0.01)；下同。

Note:aCompared with the blank group,the difference is significant (P< 0.05);ACompared with the blank group,the difference is extremely significant (P< 0.01);bCompared with the model group,the difference was significant (P< 0.05);BCompared with the model group,the difference was extremely significant (P< 0.01);The same below.

表2 RPFRE對免疫抑制小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)及肝指數(shù)的影響 Table 2 Effect of RPFRE on thymus index、spleen index and liver index of immunosuppressed mice

2.3 RPFRE對免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響

RPFRE對免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響見表3。數(shù)據(jù)顯示：與CK組相比，CY組小鼠的碳粒廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)α均降低，且碳粒廓清指數(shù)K降低極顯著(P<0.01)而吞噬指數(shù)降低顯著(P<0.05)；與CY相比，RPFRE低、高劑量組的碳粒廓清指數(shù)K均升高(P<0.05)，RPFRE高劑量組的吞噬指數(shù)α升高(P<0.05)。

表3 RPFRE對免疫抑制小鼠吞噬功能的影響 Table 3 Effect of RPFRE on the phagocytic function of immunosuppressed mice

2.4 RPFRE對免疫抑制小鼠脾T和B淋巴細胞增殖的影響

RPFRE對免疫抑制小鼠脾T和B淋巴細胞增殖的影響見表4。由表4可知，與CK比較，CY組小鼠脾T和B淋巴細胞的刺激指數(shù)SI均顯著降低(P<0.01)。與CY比較，RPFRE各劑量組T淋巴細胞增殖指數(shù)均顯著升高(P<0.01)，而B細胞的SI僅有RPFRE高劑量組達到顯著水平(P<0.05)。

表4 RPFRE對免疫抑制小鼠淋巴細胞增殖的影響Table 4 Effect of RPFRE on the proliferation in spleen lymphocytes in immunosuppressed mice

2.5 RPFRE對免疫抑制小鼠血清中細胞因子含量的影響

RPFRE對免疫抑制小鼠血清中細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ含量的影響見表5。從表5可知，與CK相比，CY小鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ含量降低(P<0.01)；與CY相比，RPFRE各劑量組及APS組的IL-2含量均升高(P<0.01)；RPFRE高劑量組IL-4含量極顯著升高(P<0.01)、IFN-γ含量顯著升高(P<0.05)。RPFRE各劑量組小鼠的IL-6含量與劑量呈正相關(guān)，但差異不顯著。

表5 RPFRE對免疫抑制小鼠IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ含量的影響 Table 5 Effect of RPFRE on contents of cytokines IL-2,IL-4,IL-6 and IFN-γ in immunosuppressed mice

2.6 RPFRE對免疫抑制小鼠免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)和補體(C3和4)的影響

RPFRE對免疫抑制小鼠免疫球蛋白IgA、IgM、IgG的影響見表6。由表6可知，與CK相比，CY小鼠IgA、IgM、IgG含量均極顯著降低(P<0.01)。與CY相比，RPFRE低劑量組IgA和IgG含量顯著升高(P<0.05)，IgM含量極顯著升高(P<0.01)；RPFRE中劑量組IgA含量顯著升高(P<0.05)；RPFRE高劑量組IgA和IgM含量極顯著升高(P<0.01)，IgG含量顯著升高。高劑量組IgA、IgM以及IgG水平與APS組相當甚至略高于APS組。

表6 RPFRE對免疫抑制小鼠免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量的影響(mg/L) Table 6 Effect of RPFRE on contents of IgA、IgM、IgG in immunosuppressed mice (mg/L)

RPFRE對免疫抑制小鼠補體C3和C4的影響見表7。由表可知，與CK相比，CY小鼠補體C3和C4含量均極顯著降低(P<0.01)；與CY相比，RPFRE低、中劑量組C4含量顯著升高(P<0.05)，C3含量有所增加但差異不顯著。APS及RPFRE高劑量組小鼠C3和C4含量升高極顯著(P<0.01)。

表7 RPFRE對免疫抑制小鼠補體C3和C4含量的影響(mg/L)Table 7 Effect of RPFRE on contents of C3 and C4 in immunosuppressed mice(mg/L)

3 討論

環(huán)磷酰胺是一種強免疫抑制藥，通過DNA烷基化破壞DNA的合成，進而抑制DNA的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成，從而導致免疫功能低下，因此常作為復(fù)制動物免疫低下模型的造模藥物[10]。研究表明，CY造模成功的小鼠常表現(xiàn)為精神萎靡、被毛松散、體重下降，有的出現(xiàn)眼結(jié)膜充血、掉毛等現(xiàn)象[11]。本試驗中，腹腔注射CY后，CY組及各試驗組小鼠均表現(xiàn)不同程度的被毛松散、精神不振，與CK組相比，CY小鼠增重極顯著降低。與CY相比，各試驗組增重有不同程度的升高這從側(cè)面反映出預(yù)先給予RPFRE，能拮抗CY所致的體重降低，對CY模型小鼠有一定的免疫保護作用。

脾臟、胸腺是重要的免疫器官，其器官指數(shù)能直觀地反映有機體的免疫功能。CY是作用顯著的免疫抑制劑，能使胸腺、脾臟萎縮，造成胸腺、脾臟指數(shù)下降[10]。研究表明，香菇多糖、茯苓多糖、銀耳多糖以及蟲草多糖均能不同程度的升高CY所致的免疫抑制小鼠的胸腺系數(shù)，且各多糖按一定比例混合而成的復(fù)合多糖效果最好[12]。款冬皂苷和多糖均能不同程度的提高小鼠胸腺和脾臟系數(shù)[13]。天門冬多糖能夠提高免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)[20]。本試驗中太子參參須提取物含有太子參多糖、太子參皂苷等多種太子參藥用成分，經(jīng)檢測該產(chǎn)品中糖含量為54.26%，皂苷含量為0.82%。課題組前期研究表明太子參多糖可以改善CY造成的免疫損傷，提高免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)，促進其淋巴細胞增殖和細胞因子(IL-2和IFN-γ)分泌[14]。本試驗結(jié)果顯示，RPFRE能拮抗CY免疫抑制作用，緩解CY所致的免疫器官萎縮，從而提高機體的免疫力。這與大多數(shù)試驗研究得出的結(jié)論“多糖能緩解機體的免疫抑制，提高機體免疫器官指數(shù)，增強免疫力”一致[15,16]。

臨床中常采用碳粒廓清法來測定吞噬細胞的吞噬指數(shù)[17]。Sun等[18]研究表明刺五加酸性多糖能緩解CY所致的小鼠外周血白細胞數(shù)目減少、巨噬細胞吞噬功能減弱，增強免疫抑制小鼠的巨噬細胞吞噬能力，提高TNF-α和IFN-γ水平。桔梗皂苷D能夠促進淋巴細胞增殖，增強巨噬細胞的吞噬能力，并可刺激淋巴細胞IL-2、IL-4和巨噬細胞TNF-α、IL-12的分泌，從而增強小鼠淋巴細胞和巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)活性[19]。本試驗中，CY小鼠K值和α值均顯著降低，這與上述研究結(jié)果一致，說明確已造成小鼠免疫抑制。RPFRE高劑量組能增強K值和α值，拮抗CY損傷，并且與陽性對照組APS作用效果相當，這同Zhang等[20]“黃芪多糖可提高正常小鼠及免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬百分率及吞噬指數(shù)”這一結(jié)論一致。說明該太子參參須提取物具有其他藥用植物的多糖、皂苷提取物同樣的功能，能緩解CY小鼠巨噬細胞吞噬能力減弱，增強CY小鼠的免疫能力。

淋巴細胞增殖是對抗原或有絲分裂原誘導的刺激的反應(yīng)，其廣泛用于評估細胞免疫應(yīng)答[21]。一般而言，ConA刺激T淋巴細胞免疫，而LPS刺激B淋巴細胞免疫。研究表明，黨參總皂苷納米乳能提高免疫抑制小鼠血清IL-2和IFN-γ水平、升高脾T細胞增殖刺激指數(shù)，從而提高免疫抑制小鼠的細胞免疫水平[22]。天門冬多糖能在Con A 或者LPS刺激下提高T、B淋巴細胞增殖率[23]。本試驗中，RPFRE借助Con A 和LPS刺激，激發(fā)脾細胞更快增殖，結(jié)果顯示RPFRE能顯著刺激T細胞增殖(P<0.01)，提高B細胞SI值。說明RPFRE能干預(yù)CY對細胞增殖的抑制，拮抗CY損傷，從而增強小鼠的免疫抵抗能力。

IL-2、IFN-γ是由TH1細胞分泌的細胞因子，主要參與細胞免疫；IL-4、IL-6由TH2細胞分泌，參與機體體液免疫。Tong等[23]研究表明，天門冬多糖能增加CY誘導的小鼠的IL-2、IL-4含量，從而提高小鼠的免疫防御功能。六苓扶正方劑量依賴性地提高模型小鼠IL-2和IgG水平[11]。丹參-苦參提取物高劑量可以顯著促進IL-6和CXCL1的分泌[24]。研究表明，太子參多糖能夠拮抗環(huán)磷酰胺對小鼠回腸中IL-6分泌的抑制作用[25]，且太子參多糖和硒化修飾以后均可以增加免疫小鼠TNF-α和IL-6的分泌[26]。本試驗中，RPFRE能抵抗CY對機體造成的免疫抑制，增加IL-2、IL-4、IFN-γ含量(P<0.05)，促進IL-6分泌(P>0.05)。結(jié)果表明RPFRE具有天然藥用植物的功能，能通過遏制細胞因子含量降低，拮抗CY所致的免疫損傷，從而增強機體防御能力。

研究表明天然中藥對免疫球蛋白IgM、IgG、IgA有正向調(diào)節(jié)作用[27]。Lin等[28]研究表明，黨參多糖和硒化黨參多糖均能夠增加免疫抑制小鼠血清中IgG和IgM的含量，且硒化修飾過后的黨參多糖效果顯著。Zhang等[29]研究表明茯苓多糖可以促進小鼠血清中IgG和IgM的生物合成，提高小鼠免疫功能。Song等[26]研究表明，硒化太子參多糖夠減緩CY所致的免疫損傷小鼠IgG和IgM的降低，從而提高免疫能力。RPFRE系天然中藥太子參的參須提取物，試驗中，高劑量RPFRE能拮抗CY對免疫球蛋白和補體分泌的抑制作用，增加IgM和IgG含量(P<0.01)，促進C3和C4分泌(P<0.01)。說明RPFRE保有天然中藥太子參的有效藥用成分，能通過調(diào)節(jié)免疫球蛋白和補體含量起到免疫保護作用。

上述結(jié)果表明，先灌胃小鼠RPFRE能通過拮抗CY所致的免疫抑制小鼠臟器指數(shù)降低，巨噬細胞吞噬功能減弱，脾T淋巴細胞增殖能力減弱，血清免疫球蛋白、補體及細胞因子含量降低等，發(fā)揮對免疫抑制小鼠免疫保護作用，該作用可能是由于RPFRE是天然藥用植物太子參的參須所提，其含有太子參參須多糖和皂苷，保有太子參的藥用價值。但有關(guān)太子參參須多糖和皂苷單獨對免疫抑制小鼠免疫調(diào)節(jié)作用仍有待進一步深入研究。