鱗柄小奧德蘑多糖對巨噬細胞免疫功能的調節作用

王 晶，史 琪，隨晶晶，常世民,,3，杜 娟，閆訓友,,3

1廊坊師范學院生命科學學院；2河北省食藥用菌資源高值利用技術創新中心；3廊坊市細胞工程與應用研究重點實驗室，廊坊 065000

多糖(polysaccharide)，又稱為多聚糖，是指由10個以上的單糖分子縮合的多聚物[1]。在自然界中廣泛分布于動物、植物和微生物中，并在真菌細胞壁中約占90%[1]。近年來研究發現，多糖具有多種重要的生物學功能，如免疫調節[2]、抗氧化[3,4]和抗腫瘤[5]等。

鱗柄小奧德蘑(Oudemansiellafurfuracea)歸屬蘑菇目膨瑚菌科狹義小奧德蘑屬[6]，其口味鮮美，營養豐富，經濟價值較高，主要種植于北京、河北、山東、江蘇等華北地區。目前對該物種的研究主要集中在栽培和活性物質提取等方面[3,7]。

巨噬細胞是機體非特異性免疫的重要組成部分，可產生腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、NO等炎癥有關的細胞因子(cytokine)或信號分子，在天然免疫和獲得性免疫中執行重要功能[2,7]。本論文通過體內實驗和體外實驗研究了初步分離純化的鱗柄小奧德蘑多糖對小鼠巨噬細胞吞噬能力和細胞因子分泌量等免疫功能的影響，為其進一步開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱗柄小奧德蘑(Oudemansiellafurfuracea)購自河北廊坊，由河北省食藥用菌資源高值利用技術創新中心完成菌種鑒定[3]。ICR小鼠為斯貝福(北京)生物技術有限公司產品(許可證號SCXK(京)2016-0002)，雄性，5～6周齡，體重25 g左右；F12K培養基為美國Sigma公司產品；特級胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)為天津灝洋生物制品科技有限公司產品；DAF-FM雙乙酸鹽(DAF-FM DA)一氧化氮(NO)熒光探針、總一氧化氮檢測試劑盒和雙辛丁酸法(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒為上海碧云天生物技術有限公司產品；小鼠TNF-α、IL-1、IL-6和白細胞介素-12(interleukin-12，IL-12)檢測試劑盒為青島海德誠生物工程有限公司產品；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、MD44透析袋(截留分子量3.5 kD)和24孔板用細胞爬片為北京索萊寶科技有限公司產品。實驗所需其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Milli-Q超純水機為美國Millipore公司產品；ALPHA 1-2 冷凍干燥機為德國Martin Christ公司產品；CKX41SF倒置顯微鏡(裝有數碼顯微照相裝置DP71)和BX53熒光顯微鏡(裝有數碼顯微照相裝置DP73)為日本Olympus公司產品；MCO-20AIC二氧化碳培養箱為日本SANYO公司產品；iMark酶標儀為美國Bio-Rad公司產品。

1.3 方法

1.3.1 鱗柄小奧德蘑多糖的提取和純化

參考Wang等[3]方法，將鱗柄小奧德蘑子實體置于50 ℃恒溫干燥箱中烘干，粉碎機粉碎、銅網過濾、95%乙醇除脂、低溫烘干后，采用熱水浸提、離心、除蛋白、透析和真空冷凍干燥等方法，得到鱗柄小奧德蘑多糖(polysaccharide fromO.furfuracea，OFP)樣品。將多糖樣品用0.09 g/L氯化鈉溶液(生理鹽水)配成母液，孔徑為0.22 μm的無菌針頭濾器抽濾后冷藏備用。

多糖含量和蛋白質含量測定分別采用苯酚-硫酸法和BCA法(蛋白質濃度測定試劑盒)。

1.3.2 巨噬細胞的收集

灌洗腹腔法。參考Zhang等[8]方法并稍改進，將小鼠處死后，75%醫用酒精中浸泡2 min，重復2次轉入超凈工作臺，取F12K培養液5 mL注入小鼠腹腔，輕柔腹部，吸取腹腔液，離心，將沉淀用F12K培養液(含10% FBS)懸浮后按5×106個/mL的細胞密度，接種至培養板中，5% CO2培養箱中37 ℃培養[9]。

1.3.3 多糖處理

體內實驗。將ICR小鼠適應性飼養3天后，隨機分為空白對照組、多糖處理組和陽性對照組，各組設5個重復，自由攝食和飲水。陽性對照組腹腔注射20 mg/L的LPS溶液1mL，多糖處理組分別腹腔注射50、100和200 mg/L的鱗柄小奧德蘑多糖溶液1 mL，空白對照組腹腔注射1 mL無菌生理鹽水，正常飼養24 h后，按“1.3.2”方法收集巨噬細胞，雞血紅細胞吞噬法測定巨噬細胞的吞噬能力，熒光探針法測定細胞中NO含量。

體外實驗。按“1.3.2”方法收集和接種ICR小鼠巨噬細胞，待細胞貼壁后，吸棄上層培養基，添加不含血清的F12K培養液，并將細胞分為陽性對照組、多糖處理組和空白對照組。陽性對照組添加終濃度為20 mg/L的LPS，多糖處理組分別添加終濃度為50、100和200 mg/L的無菌鱗柄小奧德蘑多糖溶液，空白對照組添加等量的無菌生理鹽水，繼續培養24 h后，分別收集細胞和培養上清。雞血紅細胞吞噬法測定巨噬細胞的吞噬能力，熒光探針法測定細胞中NO含量，酶聯免疫吸附實驗測定細胞培養上清中TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12的濃度。

1.3.4 細胞吞噬能力測定

雞血紅細胞吞噬法。參考Wang等[8,10]方法稍改進，收集細胞至潔凈載玻片上(體內實驗)或吸棄細胞培養板中培養液(體外實驗)，添加1%(體積比)雞血紅細胞懸液，經37 ℃孵育、磷酸緩沖溶液漂洗、4%多聚甲醛固定、吉姆薩染液(工作液)染色、流水沖洗后鏡檢。巨噬細胞的吞噬能力用吞噬百分率(%)來評價，以吞噬雞血紅細胞的巨噬細胞數量和巨噬細胞總數的比值表示[10]。

1.3.5 NO含量的檢測

熒光探針法[7]檢測巨噬細胞內NO含量。按“1.3.3”方法收集腹腔注射多糖處理24 h的巨噬細胞，離心后加入適量熒光探針。或按“1.3.2”方法收集小鼠巨噬細胞，接種至培養板(內置細胞爬片)中，添加不同濃度多糖處理后，取出細胞爬片，細胞面朝上置于濕盒中，加入適量熒光探針[7]。參照DAF-FM DA試劑盒說明，用稀釋400倍的探針，孵育細胞30 min，洗滌2次后，熒光顯微鏡拍照，軟件IPP(Image-Pro Plus)分析和測定平均光密度值(相對值)[7]。

用硝酸鹽還原酶還原硝酸鹽為亞硝酸鹽后，Griess法檢測巨噬細胞培養上清中總一氧化氮濃度。按照試劑盒說明，用超純水配制2 mmol/L NADPH，并將試劑盒中NaNO2標準品稀釋成0、2、5、10、20和40 μmol/L。實驗前將Griess reagent I和II，室溫放置30 min，在96孔細胞培養板中依次加入標準品或巨噬細胞培養上清60 μL、2 mmol/L NADPH 5 μL、FAD 10 μL和Nitrate reductase 5 μL，混勻，37 ℃孵育30 min；依次加入LDH Buffer 10 μL、LDH 10 μL，混勻，37 ℃孵育30 min；加入Griess reagent I 50 μL和Griess reagent II 50 μL，混勻后室溫孵育10 min。每組設3個重復。酶標儀測定A540 nm，根據NaNO2濃度標準曲線計算各實驗組NO濃度。

1.3.6 TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12分泌量的測定

酶聯免疫吸附實驗(雙抗體夾心法)[9]。參照試劑盒說明操作，并根據各標準品的濃度曲線計算培養上清中TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12濃度。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 鱗柄小奧德蘑多糖含量

以葡萄糖為標準糖，采用苯酚-硫酸法測定鱗柄小奧德蘑多糖樣品中糖含量，得到葡萄糖濃度x與吸光度值A的直線回歸曲線為y=0.016 8x+0.031 6；決定系數[11]r2=0.998 0，表示糖濃度與吸光度值之間具有良好的線性正相關關系，經計算，鱗柄小奧德蘑多糖樣品中糖含量為88.75%±1.24%，考慮到多糖提取工藝中的多次透析過程和透析袋的截留的分子量(3.5 kD)大小，認為鱗柄小奧德蘑多糖樣品中多糖含量為：88.75%±1.24%。以牛血清白蛋白BSA為標準蛋白，采用BCA法測定鱗柄小奧德蘑多糖樣品中蛋白質含量，得到蛋白質濃度x與吸光度值A的直線回歸曲線為y=0.743 9x+0.007 9；決定系數r2=0.991 8，表示蛋白質濃度與吸光度值之間具有良好的相關關系，經計算，鱗柄小奧德蘑多糖樣品中蛋白質含量為0.96%±0.05%。說明，提取的鱗柄小奧德蘑多糖中的蛋白質已被有效去除。

2.2 體外培養的小鼠巨噬細胞

采用F12K培養液灌洗腹腔、離心收集和無菌接種等方法，啟動小鼠巨噬細胞的原代培養。結果顯示，體外培養的小鼠巨噬細胞透光性較好，接種培養板24 h后，絕大多數細胞已貼壁或半貼壁，貼壁牢固，呈不規則形態(見圖1)，這與Ni[12]和Yu[13]等分離和體外培養的巨噬細胞生長狀態相似。巨噬細胞為終末分化細胞，體外無法增殖，為防止胎牛血清(FBS)中免疫相關蛋白或細胞因子對實驗結果的影響，體外接種培養24 h后，將含10% FBS的F12K

圖1 接種培養24 h后的小鼠巨噬細胞(標尺=100 μm)Fig.1 Murine peritoneal macrophages cultured in vitro for 24 h (scale=100 μm)

培養液更換為不含血清的F12K培養液。研究顯示，短期無血清培養不會影響細胞的RNA的轉錄和蛋白質的合成[14]，但時間過長(超過24 h)會導致培養細胞的大量死亡[15]，故本實驗將鱗柄小奧德蘑多糖處理的時間控制在24 h。

2.3 多糖對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響

巨噬細胞由血液循環中的單核細胞進入組織后分化而來，能夠吞噬和清除凋亡細胞及非功能性的胞外成分[16]。本實驗采用雞血紅細胞吞噬法檢測了多糖處理前后小鼠巨噬細胞吞噬能力的變化。結果顯示，與空白對照組相比，20 mg/L LPS處理組和200 mg/L鱗柄小奧德多糖處理組巨噬細胞的吞噬能力顯著增強(見圖2)。

2.4 多糖對小鼠巨噬細胞合成NO的影響

NO是在外界信號刺激下，由巨噬細胞、血管內皮細胞或神經細胞等多種細胞合成的、可跨質膜自由擴散的信號分子[17]。細胞內的NO可使用熒光探針DAF-FMDA檢測，熒光的強弱間接反映細胞中NO的含量[7,9]；細胞培養上清中NO含量可使用總NO測定試劑盒(硝酸鹽還原酶+Griess法)檢測[7,9]。實驗結果顯示，與空白對照組(生理鹽水組)相比，腹腔注射50～200 mg/L鱗柄小奧德蘑多糖處理24 h，小鼠巨噬細胞中熒光探針的平均光密度值均顯著增強(P<0.05)，細胞培養上清中總NO濃度顯著增加(P<0.05)(見表1)，具有濃度依賴性(見圖3和圖5)；體外培養體系中添加終濃度為50～200 mg/L鱗柄小奧德蘑多糖處理24 h，巨噬細胞中熒光探針的平均光密度值亦顯著增強(P<0.05)，細胞培養上清中總NO濃度顯著亦增加(P<0.05)(見表1)，具有濃度依賴性(見圖4和圖5)；相同濃度的多糖體內外處理24 h對小鼠巨噬細胞NO的合成無顯著性差異。說明，鱗柄小奧德蘑多糖處理24 h可促進巨噬細胞細胞質中NO的合成量。

圖2 鱗柄小奧德多糖對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響Fig.2 Effect of OFP on phagocytic activity of murine peritoneal macrophages.注：*與空白對照組相比，P<0.05。Note:*Compared with control group,P<0.05.

2.5 多糖對小鼠巨噬細胞TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12分泌量的影響

為進一步研究鱗柄小奧德蘑多糖對巨噬細胞免疫功能相關的細胞因子分泌量的影響，收集體外實驗的巨噬細胞培養上清，并參照試劑盒說明進行酶聯免疫吸附實驗。結果顯示，原代培養的小鼠巨噬細胞可分泌TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12(見表1)，其中TNF-α、IL-1和IL-6的濃度較高，分別為64.40±1.50、62.60±1.75和96.33±2.13 ng/L(見表1)，IL-12濃度較低，只有3.76±0.04 ng/L(見表1)。與空白對照組相比，鱗柄小奧德蘑多糖處理可不同程度的影響小鼠巨噬細胞對TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12的分泌量。其中，終濃度為50～200 mg/L的鱗柄小奧德蘑多糖處理24 h可極顯著提高巨噬細胞對IL-6和IL-12的分泌量(P<0.01)(見表1)，終濃度為100～200 mg/L的鱗柄小奧德蘑多糖可顯著提高巨噬細胞對TNF-α、IL-1的分泌量(P<0.05)(見表1)。

圖3 NO熒光探針標記的體內實驗的小鼠巨噬細胞(標尺=100 μm)Fig.3 Murine peritoneal macrophage treated by OFP in vivo and stained by NO fluorescence probe (scale=100 μm)注：A：空白對照組；B：20 mg/L LPS處理組；C～E：50、100、200 mg/L鱗柄小奧德蘑多糖處理組；下同。Note:A:Control;B:Treated with 20 mg/L LPS;C～E:Treated with 50,100 and 200 mg/LOFP,respectively；The same below.

圖4 NO熒光探針標記的體外培養的小鼠巨噬細胞(標尺=100 μm)Fig.4 Murine peritoneal macrophages cultured in vitro,treated by OFP and stained by NO fluorescence probe (scale=100 μm).

圖5 各組小鼠巨噬細胞中NO熒光的平均光密度值Fig.5 The average optic density of NO fluorescence in murine peritoneal macrophages in different groups.注：*與空白對照組相比，P<0.05。Note:*Compared with control group,P<0.05.

3 討論和結論

目前，對鱗柄小奧德蘑多糖的生物學活性的研究，集中在抗氧化活性和免疫調節方面。如Ma[18]通過灌胃小鼠，發現一定鱗柄小奧德蘑多糖可提高實驗動物CD4+T淋巴細胞含量，促進脾淋巴細胞的增殖，提高血清中IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α含量。本實驗室前期通過建立細胞共培養體系，研究了鱗柄小奧德蘑多糖對其中的大鼠肺巨噬細胞系和結直腸癌細胞的影響。發現鱗柄小奧德蘑多糖可提高肺巨噬細胞系對NO和TNF-α的分泌，從而抑制結直腸癌細胞的增殖[7]。以上研究過程和結果均未涉及鱗柄小奧德蘑多糖對體外培養的正常的巨噬細胞免疫功能的調節作用。

表1 鱗柄小奧德蘑多糖對小鼠巨噬細胞NO、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12分泌量的影響Table 1 Effects of OFP on the secretion of NO、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12 of murine macrophages.

注：與空白對照組相比，*P<0.05;**P<0.01。

Note:Compared with control group,*P<0.05;**P<0.01.

研究發現，LPS或其他免疫調節劑的刺激，可引起巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞[19,20]，表達NO[21]、TNF-α、IL-1和IL-6等多種細胞因子或信號分子[22]，產生活性氮或活性氧[23,24]，調節機體的免疫功能[7]、抑制病原菌增殖[22]和誘導細胞凋亡[24]。

為了深入了解鱗柄小奧德蘑多糖對機體正常的巨噬細胞的影響作用，本論文采用灌洗腹腔的方法，獲得了原代培養的小鼠巨噬細胞。利用巨噬細胞的體外培養體系并結合腹腔注射多糖實驗，采用熒光探針標記、總一氧化氮測定和酶聯免疫吸附實驗等方法，較系統的研究了鱗柄小奧德蘑多糖對小鼠巨噬細胞吞噬能力、細胞中NO合成量、培養上清中NO和細胞因子分泌量的影響。結果顯示，一定濃度的鱗柄小奧德蘑多糖處理可顯著增強巨噬細胞吞噬能力，提高細胞對NO、TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12的合成和分泌。推測，鱗柄小奧德蘑多糖可刺激巨噬細胞極化為M1型，進而調節機體的免疫能力[9]。研究結果對相關功能性食品或保健品的開發提供理論基礎。