放線菌JXJ 0170對銅綠微囊藻的溶藻活性

肖 瑤，田寶玉，張炳火

1福建師范大學生命科學學院，福州 350000；2九江學院藥學與生命科學學院，九江 332000

藍藻水華是一個突出的世界性環境問題[1]，爆發時產生的藍藻毒素等有毒物質嚴重威脅人類健康[1,2]，給魚類等水產養殖業帶來巨大經濟損失[3]。因此，藍藻水華的防治受到國內外的高度關注。

長期以來，藍藻水華的防治主要依賴于CuSO4等化學殺藻劑[4]。雖然這些傳統化學殺藻劑控制水華快速高效[5]，但它們選擇性差，抑制整個浮游生物，毒害水生動物，并導致重金屬富集[5,6]，造成二次污染，對水體生態系統具有潛在危害[7]。因此，尋找環境友好的新型殺藻劑具有重要的意義。

放線菌以代謝產物種類極為豐富而著稱。研究表明，水陸環境中均存在大量溶藻放線菌，目前報道的主要是其中的鏈霉菌屬，諸如不產色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)[8]、生暗鏈霉菌(S.phaeofaciens)[9]、脫葉鏈霉菌(S.exfoliatus)[10]、寢屋川鏈霉菌(S.neyagawaensis)[11]、灰霉素鏈霉菌(S.griseinus)[12]、九江鏈霉菌(S.jiujiangensis)[13]、廬山鏈霉菌(S.lushanensis)[14]和S.eurocidicus[15]等，它們對水華藍藻具有較好的特異性，可分泌包括蛋白質[11]、氨基酸[9,13]、抗生素[16,17]和其他多種活性成分[15,18]，產生溶藻作用。因此，從放線菌及其代謝產物中篩選高效環保的藍藻水華防治劑具有很大前景。本文研究了放線菌JXJ 0170溶藻活性成分的發酵時間、孢子、胞外產物和菌絲體的溶藻效率、溶藻活性成分的部分理化性質和作用機制、發酵液對水生動物的毒性以及該菌在野外對水華的防治效果等，以評價該菌在研制藍藻水華防治劑方面的潛力。

1 材料與方法

1.1 研究菌株、銅綠微囊藻和培養基

放線菌JXJ 0170，為本實驗室從廬山土樣中分離獲得。銅綠微囊藻(MicrocystisaeruginosaFACHB-905)，購自中國科學院武漢水生生物研究所淡水藻種庫。

放線菌JXJ 0170發酵培養基和藻培養基見參考文獻[19]。

1.2 溶藻菌株初步鑒定

采用插片法觀察菌絲形態特征。采用溶菌酶法提取菌株基因組DNA，并擴增其16S rRNA基因序列，從數據庫EzBioCloud’s Identify Service(http://www.ezbiocloud.net/identify)中調出相似性高的菌株序列，用軟件CLUSTAL_X1.83進行多重序列比對，軟件MEGA 5構建16S rRNA基因序列系統進化樹。

1.3 菌株發酵

用無菌水洗下菌株斜面上的孢子，將孢子懸液接入液體發酵培養基中，使孢子終密度為1.0×105CFU/mL，于28 ℃、160 rpm條件下培養，每24 h取樣1次，樣品置于無菌離心管內離心(4 500 rpm，20 min)，取上清液2 mL，加入100 mL藻液(5.0×106CFU/mL)中，空白對照組加入2 mL無菌水，培養基對照組加入2 mL無菌發酵培養基，于25 ℃、光照強度為3 000 lx的人工氣候箱中靜置培養，光暗比為12∶12，每天搖動4次，每次約30 s，3天后鏡檢藻細胞數量，每組試驗做3個平行。

1.4 溶藻活性成分的理化性質

1.4.1 對熱和酸堿處理的穩定性

將發酵6天的放線菌發酵上清液進行以下處理：(1)分別置于40、50、60、70、80、90和100 ℃的水浴處理2 h后，冷卻至室溫；(2)用1.0 mol/L的NaOH和HCl溶液，將樣品pH值分別調至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，靜置24 h后再將pH值調至原始值。取各處理樣品2 mL加入100 mL藻液(5.0×106CFU/mL)中，對照組加入2 mL無菌水，培養3天后鏡檢藻細胞密度，每組試驗做3個平行。

1.4.2 發酵產物溶藻活性

將發酵上清液減壓蒸餾濃縮至原體積的1/3，用乙酸乙酯充分萃取，除去乙酸乙酯即得極性較小的脂溶性組分；萃余相減壓蒸餾至膏狀物后，分別先后用丙酮、甲醇和無菌水充分溶解，除去各溶劑后即分別得到丙酮、甲醇和水溶解的組分，重新減壓蒸餾、稱重；再將4個組分用相應溶劑重新溶解，使各組分樣品濃度相同，取一定體積的樣品溶液于無菌濾紙片上，使每張濾紙片含1 mg樣品，待溶劑完全揮發后，再將濾紙片置于藻平板上，3天后觀察溶藻圈的產生情況。

1.5 溶藻機制

1.5.1 對藻細胞形態的影響

在藻液(1.0×107/mL)中加入2%(V/V)的放線菌發酵上清液(空白對照不加)，培養3天后按照參考文獻[20]制樣并觀察藻細胞形態變化。(1)將藻液離心，收集沉淀，加入2.5%的戊二醛(用0.1 mol、pH7.0的磷酸緩沖液配制)固定藻細胞樣品1 h；(2)先后采用50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液對藻細胞脫水(每次脫水時間不超過5 min)；(3)將樣品置于蓋玻片上自然干燥；(4)用掃描電鏡(VEGAⅡLSU，TESCAN)對藻細胞形態進行觀察。

1.5.2 對藻細胞光合作用的影響

采用密封培養裝置(上有導管可通氣體或加入液體樣品)培養藻液，藻液(1.0×107CFU/mL)中加入2%的放線菌發酵上清液，光照條件下培養，產生的氧氣通入裝滿液體的密閉裝置(上有一根內徑1 mm的兩端開口的玻璃管)，記錄玻璃管中的水柱高度。對照組不加代謝產物。根據水柱高度判斷放線菌代謝產物抑制藻細胞光合作用的效率。

1.6 孢子、發酵上清液和菌絲體的溶藻活性

根據文獻[19]制造藻平板，將放線菌孢子接種于藻平板上，25 ℃、3 000 lx光照強度下靜置培養，每天觀察孢子萌發、菌絲生長和藻平板顏色變化情況。采用1.4中的條件培養菌株JXJ 0170，6天后離心，分別收集上清液和菌絲體備用。在藻液(5.0×106CFU/mL)中加入1%、2%和3%(V/V)的上清液，培養3天后鏡檢藻細胞密度。將菌絲體用無菌水洗滌3次，除去胞外產物，再在無菌條件下稱取0.5、1.0、1.5和2.0 g菌絲體(濕重)分別加入100 mL藻液(5.0×106CFU/mL)中，培養3天后鏡檢藻細胞密度，每組試驗做3個平行。以不加菌藻液為對照組。

1.7 發酵液對水生動物的毒性

取20條生長良好的彭澤鯽魚(平均重量約50 g/條)，放入45 L自來水中，并加入1%(V/V)的放線菌發酵液和100 g大米，每天換水一次，同時加入1%(V/V)的發酵液和100 g大米，連續飼喂7天，觀察魚有無中毒死亡現象，并計算死亡率。取生長良好的田螺120個(平均重量約2.87 g/個)，放入5 L自來水中，并加入1%(V/V)的發酵液和50 g小白菜葉，每天換水一次，同時加入1%(V/V)的發酵液和50 g小白菜葉，連續飼喂7天，觀察田螺有無中毒死亡，并計算死亡率。對照組以無菌液體發酵培養基代替放線菌發酵液，其他條件相同。試驗時室溫15 ℃，所有試驗重復3次。

1.8 野外水華防治試驗

試驗池塘位于九江市郊區農村，面積約為1 660 m2，平均水深約為1.5 m，試驗前在池塘中間筑壩，將池塘一分為二。兩個分區水中分別于6月1日和9月1日投放硝酸鈉和復合肥各50 kg，增加水中氮磷元素含量，試驗組投放20 L溶藻放線菌發酵液，對照組投放20 L無菌發酵培養基，每月1號和15號于水面15～20 cm處取樣一次，取樣點3個，采用熱乙醇法[15]測樣品的葉綠素a(Chlorophyll a，Chl-a)含量。試驗時間，2018年6月1日至2018年10月30日。

1.9 數據統計與分析

采用軟件SPSS19.0對數據進行統計處理。確定3次重復實驗的平均值(mean value)和標準偏差(standard deviation，SD)，繪圖數據取3次試驗的平均值，試驗組與對照組數據采用單因素方差分析，P≤0.05為差異顯著，P≤0.01為差異極顯著。溶藻效率=(1-試驗組藻細胞密度或Chl-a含量/對照組藻細胞密度或Chl-a含量)×100%。

2 結果與分析

2.1 菌絲形態特征和16S rRNA基因序列分析

放線菌JXJ 0170氣生菌絲灰白色，孢子絲鏈狀，孢子卵圓形(圖1)。16S rRNA基因序列(1535 bp，GenBank登錄號：KY613504)分析表明，該菌是鏈霉菌屬(Streptomyces)的成員，且與S.anulatusNRRL B-2000T、S.cyaneofuscatusNRRL B-2570T、S.fulvissimusDSM 40593T和S.luridiscabieiNRRL B-24455T的親緣關系最近，相似性均為99.93%，然而該菌僅與S.cyaneofuscatus和S.griseussubsp.griseusKCTC 9080T聚在一大支上(圖2)，而與其它三株菌聚在不同分支上，因此，該菌的確切分類學地位尚需要進一步的試驗數據。

2.2 菌株溶藻發酵時間

如圖3所示，試驗條件下培養3天后，空白對照組藻細胞密度由5.0×106CFU/mL增加到1.41×107CFU/mL，發酵培養基對照組(即未接菌的培養基)藻細胞密度只有空白對照組的78.51%，溶藻效率為21.49%(P<0.01)，這說明發酵培養基中的一些成分對藻細胞生長有抑制作用，但這些物質隨著孢子的萌發與菌絲生長而被消耗。因此，接種培養1天后的發酵上清液對藻細胞基本沒有溶藻活性，2天后的發酵上清液甚至促進了藻細胞的生長，但此后發酵液的溶藻活性迅速增加，5天后到達91.85%(P<0.01)，6天后變化不大，8天后略有下降。因此，確定該菌發酵時間為6天。

圖1 放線菌JXJ 0170培養4天后的孢子絲掃描電鏡照片Fig.1 Scanning electron micrograph of spore chains of actinomycete JXJ 0170 after culturing for four days

圖2 以鄰接法構建菌株JXJ 0170系統進化樹Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of strain JXJ 0170 注：>50%的步長值(以重復1 000次的百分率表示)在節點處標注；標尺：0.05%的序列分歧度。Note:Bootstrap values (expressed as percentages of 1 000 replications) > 50 % are shown at the nodes.Bar,0.05% sequence divergence.

圖3 菌株JXJ 0170不同發酵時間上清液的溶藻效率Fig.3 Alga-lysing efficiency of fermentation broth supernatant of strain JXJ 0170 at different culture time注：**表示試驗組與對照組在P<0.01水平上差異顯著。Note:** indicated the significant differences between the controls and the tests at the level P<0.01.

2.3 溶藻活性成分的理化性質

2.3.1 對熱和酸堿處理的穩定性

如圖4所示，未進行熱處理的試驗組(28 ℃)藻細胞密度為1.20×106CFU/mL，為對照組1.43×107CFU/mL的8.49%，即溶藻效率為91.51%；處理溫度≤70 ℃時，發酵上清液的溶藻活性沒有顯著變化，溶藻效率在90.23%以上，達到未處理組溶藻效率的98.60%以上；但處理溫度分別為80～100 ℃時，發酵上清液的溶藻活性比未處理組降低了4.38%～31.78%(P<0.05或P<0.01)。如圖4所示，在pH7.0～8.0時發酵上清液溶藻效率最高，約為91.37%，當處理pH≤7.0時，發酵上清液的溶藻效率隨pH值的增加而增加，當處理pH≥8.0時，發酵上清液的溶藻效率隨pH值的增加而降低。

2.3.2 發酵產物溶藻活性

試驗結果顯示，乙酸乙酯和丙酮溶解的樣品沒有形成溶藻圈，甲醇溶解的樣品形成的溶藻圈直徑約為1.7 cm(圖5 C)，而水溶性成分形成的溶藻圈直徑約為3.5 cm(圖5 D)，這說明菌株JXJ 0170產生的溶藻活性成分主要是水溶性物質。

2.4 溶藻機制

2.4.1 對藻細胞形態的影響

掃描電鏡觀察結果(圖6)顯示，空白對照組的藻細胞球形，表面有黏液，且有大量細胞正在分裂繁殖；而加了菌株JXJ 0170發酵產物的試驗組藻細胞變形，且其表面粘性物質喪失，細胞壁和細胞膜穿孔，最終藻細胞裂解死亡。

2.4.2 對藻細胞光合作用的影響

試驗結果顯示，培養6 h后，空白對照組的藻細胞培養裝置壁上有大量氣泡，其玻璃管中的液柱高度為27.58±0.85 cm；而加了菌株JXJ 0170發酵產物的試驗組藻培養裝置的壁上沒有氣泡，其玻璃管中的液柱高度僅為8.18±0.37 cm，僅為空白對照組的29.66%(P<0.01)，即6 h內菌株JXJ 0170發酵產物對藻細胞光合作用的抑制率達到70.34%，這說明該菌發酵產物對銅綠微囊藻的光合作用具有較強的抑制作用。

圖4 不同溫度和pH處理后的發酵上清液的溶藻效率Fig.4 Alga-lysing efficiencies of fermentation broth supernatant treated with different temperatures and pH values注：**表示試驗組與對照組在P<0.01水平上差異顯著，*和**分別表示未處理組與處理組在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。Note:** indicated the significant differences between the controls and the tests at the level P<0.01;* and ** indicated the significant differences between the untreated groups and the treated groups.

圖5 菌株JXJ 0170發酵產物的溶藻活性Fig.5 Alga-lysing activities of fermentation substances of strain JXJ 0170 注：A、B、C和D分別為乙酸乙酯、丙酮、甲醇和水的提取物。Note:A,B,C and D,extracted by acetic ether,acetone,methanol and H2O,respectively.

圖6 菌株JXJ 0170代謝產物對藻細胞形態的影響Fig.6 The influences of metabolites produced by strain JXJ 0170 on the morphology of algae cells 注：A和B分別為對照組和試驗組的藻細胞。Note:A and B are the cells in control and test groups,respectively.

2.5 孢子、發酵上清液和菌絲體的溶藻活性

2.5.1 孢子的溶藻活性

菌株JXJ 0170的孢子在藻平板上能夠萌發生長，并形成溶藻圈，隨后其生長范圍和溶藻圈直徑均逐漸擴大，15天后單菌落溶藻圈直徑為12.71 mm，25天后溶藻圈直徑達到29.42 mm，這說明該菌株孢子在缺乏有機碳源的組合培養基中能夠正常萌發、直接殺死藻細胞，并利用藻細胞裂解后釋放的有機物作為營養成分繼續生長，再產生溶藻活性成分，進而發揮活性成分溶藻作用。

2.5.2 發酵上清液和菌絲體的溶藻活性

如圖7所示，發酵上清液和菌絲體均有良好的溶藻活性，且呈劑量效應。當上清液劑量為1.0%(V/V)，3天后藻細胞密度為2.8×106CFU/mL，是對照組1.31×107CFU/mL的21.37%，即溶藻效率為78.63%，當劑量為3.0%時，溶藻效率達到96.70%；在藻液中加入0.5 g菌絲體，3天后溶藻效率為50.51%，當使用劑量增到2.0 g時，溶藻效率達到93.39%。

2.6 發酵液對水生動物的毒性

試驗結果顯示，試驗組和對照組的鯽魚生長均正常，未出現死亡，這說明菌株JXJ 0170及其代謝產物對鯽魚的生長沒有不利影響，不會導致魚類中毒死亡。田螺試驗結果表明，試驗組和對照組的田螺死亡率分別為7.22%±1.92%和6.67%±3.00%，沒有顯著差異(P>0.05)，因此，菌株JXJ 0170及其發酵產物對軟體動物田螺也沒有顯著性致死作用。

2.7 野外防治試驗

如圖8所示，在試驗期間，試驗組池塘中的水沒有出現明顯顏色變化，水面水樣雖然有懸浮顆粒存在，但基本無色，且透明(圖8 A)；對照組池塘水的顏色逐漸變綠，其水面水樣深藍綠色，不透明，水面漂浮一層藍綠色的浮膜(圖8 B)。水面15～20 cm下的水樣，對照組葉綠素a含量在試驗期間，由起始0.008 8±0.001 6 mg/L逐漸增加到0.126 0±0.008 1 mg/L，而試驗組葉綠素a含量為0.005 8±0.000 3～0.023 7±0.000 5 mg/L(圖9)，只有對照組的6.20%～24.20%，對水華的防治效率為75.80%～93.80%。

圖7 菌株JXJ 0170發酵上清液和菌絲體的溶藻效率Fig.7 Alga-lysing efficiencies of fermentation broth supernatant and mycelia of actinomycete strain JXJ 0170注：1～3分別為1%、2%和3%的發酵上清液；4～7分別是濕重為0.5、1.0、1.5和2.0 g的菌絲體。**表示試驗組與對照組在P<0.01水平上差異顯著。Note:1-3 were the fermentation broth supernatant of 1%,2% and 3%,respectively;4-7 were mycelia of wet weight 0.5,1.0,1.5 g and 2.0 g,respectively.** indicated the significant differences between the test and control at the level P<0.01.

圖8 試驗組和對照組池塘的表面水樣顏色Fig.8 Surface water color of the ponds of the experimental group and control group 注：A和B分別為試驗組和對照組的池塘水面。Note:A and B and the surfaces of test and control ponds,respectively.

圖9 野外水華防治的試驗組和對照組葉綠素a含量Fig.9 The chlorophyll a contents of the experimental group and control group of water bloom prevention and cure in the wild注：**表示試驗組與對照組在P<0.01水平上差異顯著。Note:** indicated the significant differences between the test and the control at the level P<0.01.

3 討論與結論

放線菌JXJ 0170是鏈霉菌屬的成員，與該菌16S rRNA基因序列親緣關系最近的鏈霉菌均未見溶藻活性的報道，這說明該菌是一株新的溶藻鏈霉菌。

微生物一般可通過兩種作用方式溶藻：微生物細胞接觸藻細胞后導致藻細胞溶解，即直接溶藻[21]、通過分泌活性成分而導致藻細胞溶解，即間接溶藻[9]。目前文獻報道的放線菌一般通過分泌活性成分而發揮溶藻作用[9,11,15-18]。本研究表明，菌株JXJ 0170發酵上清液具有很強的溶藻活性，且具有一定的劑量效應，這說明該菌能通過分泌活性成分而發揮間接溶藻作用；同時，該菌的菌絲體和孢子也具有很強的溶藻活性，特別是其孢子在藻平板上能夠萌發，并表現出良好的溶藻活性，這說明該菌亦具有直接溶藻作用。

目前文獻報道的鏈霉菌分泌的溶藻活性成分，多是熱穩定性和酸堿穩定性較好的非蛋白質物質[9,15-18]。菌株JXJ 0170分泌的溶藻活性成分對高溫和酸堿處理相對較穩定，這說明該活性成分也是非蛋白質性質的，但具體是何種物質還需要進一步的研究。

鏈霉菌產生的溶藻活性化合物能夠促進藻細胞活性氧的產生，抑制其抗氧化劑的合成，破壞葉綠素a、細胞膜和細胞壁[15]，最終導致藻細胞死亡，本研究結果也證明了這一點。

Sigee等[10]研究表明，脫葉鏈霉菌(S.exfoliatus)RG12在實驗室可控條件下具有很強的溶藻活性，但在野外條件下，其溶藻活性大大降低，因而難以用來防治藍藻水華。本研究表明，菌株JXJ 0170無論在實驗室可控條件下，還是在野外全開放條件下，均具有較好的溶藻效果，且該菌的溶藻作用方式多樣，對魚類和軟體動物等水生經濟動物生長沒有不良影響，因此，該菌在研制高效、環保的放線菌源藍藻水華防治劑方面具有較大的潛力。