結(jié)合PRiME HLB凈化快速測定動物源性食品中二硝托胺殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

龐李艷，鐘名琴，吳雯娟*，黃 婷，譚 磊

（1.深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，廣東 深圳 518000；2.廣東省市場監(jiān)督管理局食用農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管重點實驗室，廣東 深圳 518000）

二硝托胺，又名球痢靈，是20 世紀(jì)60 年代法國Dow 公司研發(fā)的一種化學(xué)合成類抗球蟲藥[1-2]。于1989 年在我國批準(zhǔn)使用，主要作用于預(yù)防和治療肉雞和蛋雞盲腸和小腸球蟲病（產(chǎn)蛋期禁用）。因其高效、低毒、代謝速度快、抗藥性小、性能穩(wěn)定等特點被普遍使用[3]。二硝托胺可降低球蟲卵囊檢出率和肉雞死亡率，增強免疫力，提高飼料轉(zhuǎn)化率和生長性能等[4-5]。然而，長時間過高濃度使用反而會導(dǎo)致雞生長速度緩慢、產(chǎn)蛋停止、共濟(jì)失調(diào)、抑郁、飼料轉(zhuǎn)化率低等癥狀，造成的藥物殘留也將導(dǎo)致環(huán)境和人體健康的潛在危害[6]。為保障動物源性食品的食用安全，國內(nèi)外制定了相應(yīng)的最大殘留限量（MRLs）。日本和歐盟明確雞肉中二硝托胺的 MRLs 為 0.1 μg·kg-1，我國農(nóng)業(yè)部235 號公告對二硝托胺的MRLs 也作出了相應(yīng)規(guī)定。目前，有關(guān)二硝托胺的檢測方法主要有凱氏定氮法、薄層層析法、剩余量回滴法、分光光度法、高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法等[2,7-12]。其中HPLC-MS/MS法靈敏度高、選擇性強，適用于復(fù)雜基質(zhì)中二硝托胺殘留的確證分析[13]。進(jìn)出口動物源性食品中二硝托胺殘留量的測定液色譜-質(zhì)譜法（SN_T 2453-2010）是動物組織中二硝托胺的唯一檢測標(biāo)準(zhǔn)，該方法前處理復(fù)雜、檢測效率低。肉類樣品基質(zhì)復(fù)雜，蛋白質(zhì)、脂肪及磷脂等干擾物多[14]。Oasis PRiME HLB 是種增強型新型反相SPE 吸附劑，具有特殊設(shè)計的篩板、填料及生產(chǎn)工藝，能有效降低質(zhì)譜分析中磷脂等非極性干擾物產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)，凈化效果優(yōu)于正己烷，且無需活化平衡[15-17]。其樣品前處理過程簡單、快速、方便，數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，還可延長色譜柱壽命、減少儀器維護(hù)成本。本研究基于Oasis PRiME HLB 一步式凈化法，建立動物源性食品中二硝托胺殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Aglient 1290 超高效液相色譜儀（美國Aglient公司）；AB Sciex Triple QuadTM5500 質(zhì)譜儀（美國AB Sciex 公司），配有電噴霧（ESI）離子源；NEVAP-112 型全自動氮吹儀（美國Organomation）；MTV-100 多管渦旋混合儀（杭州奧盛儀器有限公司）；梅特勒PL602E 型天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Sigma 3-18KS 離心機（德國Sigma）；一級水由Milli-Q Integral 3 型超純水儀（法國Milli-Q）制取；奧特賽恩斯AS 系列超聲波清洗機（奧特賽恩斯儀器有限公司）；Waters Oasis PRiME HLB（規(guī)格：6cc 200 mg）固相萃取柱（美國Waters公司）。

二硝托胺（Dinitolmide，CAS：148-01-6）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為德國Dr.Ehrenstorfer 公司產(chǎn)品，其純度高于97.0%。甲醇、乙腈、甲酸等有機試劑均色譜純，購自德國Merck。

1.2 提取液的制備

準(zhǔn)確量取乙腈800 mL，加入純水200 mL 制得乙腈水溶液（80+20，V1+V2），再加入甲酸2 mL，超聲10 min，得0.2%甲酸-乙腈水溶液（0.2+80+20，V1+V2+V3）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

準(zhǔn)確稱取二硝托胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈溶解并稀釋成濃度為1.00 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃下避光保存，保存期為6個月。需要時，再準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈逐級稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 樣品處理

1.4.1 提取

準(zhǔn)確稱取經(jīng)充分絞碎且均質(zhì)的新鮮雞肉組織2.5 g（精確至0.01 g）于50.0 mL 離心管中，加入0.2%甲酸-乙腈水溶液10 mL，水平振蕩器上渦旋振蕩1 min后，超聲提取5 min。于高速冷凍離心機8 000 r·min-1離心5 min，收集上清液。

1.4.2 凈化

取4.0 mL 上清液以1 滴·s-1的流速直接過上述Waters Oasis PRiME HLB 固相萃取柱，并將全部流出液收集于干凈的玻璃小管中。準(zhǔn)確移取上述流出物2.5 mL于15 mL帶刻度離心管中，40 ℃水浴下氮吹至液體體積少于0.5 mL，用甲酸-甲醇水溶液（甲酸：甲醇：水=0.09：10：90，V1：V2：V3）定容至1.0 mL，混勻。復(fù)溶液過0.22 μm 微孔濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5 UPLC-MS/MS條件

1.5.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）；流動相A為純水；流動相B為甲醇（色譜純）；柱溫40.0 ℃；進(jìn)樣體積5.0 μL。具體梯度洗脫程序見表1。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓：-4 500 V；離子源溫度：550 ℃；霧化器壓力：55.0 psi；輔助加熱器壓力：55.0 psi；氣簾氣壓力：35.0 psi；碰撞氣壓力：9 psi。保留時間、定性/定量離子對、碰撞能量及去簇電壓見表2。空白基質(zhì)及空白基質(zhì)中添加二硝托胺藥物5.00 μg·kg-1的液相色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

表2 質(zhì)譜參數(shù)

圖1 空白基質(zhì)及空白基質(zhì)中添加5.00 μg·kg-1二硝托胺的色譜

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系

在空白基質(zhì)樣品中分別加入2.50、5.00、25.0、50.0、250 μg·kg-1一系列濃度的空白添加試樣，在上述優(yōu)化后的實驗條件下進(jìn)行提取、凈化和濃縮，待儀器穩(wěn)定后依次進(jìn)樣分析，以目標(biāo)物峰面積 A 為縱坐標(biāo)、目標(biāo)物濃度 X（μg·kg-1）為橫坐標(biāo)，制得基質(zhì)加標(biāo)工作曲線。二硝托胺在2.50～250 μg·kg-1范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，且相關(guān)系數(shù)R≥0.997。二硝托胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性參數(shù)見表3。

由于電噴霧離子源（ESI）易受樣品基質(zhì)的影響，該方法通過空白基質(zhì)加標(biāo)制作工作曲線的方式可有效克服基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果準(zhǔn)確性帶來的影響，在一定程度上可消除試驗過程中的系統(tǒng)誤差。

2.2 方法檢出限與定量限確定

采用在空白基質(zhì)中做二硝托胺添加水平為5.00 μg·kg-1的 7 平行陽性添加試驗，按照 1.4 方法進(jìn)行前處理，上機測得二硝托胺的含量分別為4.734、 4.490、 4.270、 4.144、 4.569、 4.211 和4.289 μg·kg-1。計算得樣本中二硝托胺含量的平均值 -X為4.39 μg·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb為0.215。根據(jù)公式（LOD/LOQ）=（k×Sb×C）/-X（k為置信因子，一般檢出限（LOD）取3，定量限（LOQ）取10；C 為添加濃度水平，μg·kg-1）計算得，LOD和LOQ分別為0.735和2.45 μg·kg-1，見表3。

2.3 方法回收率和精密度驗證

在空白雞肉樣品中分別添加低、中、高3個不同水平的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個水平6個平行，在優(yōu)化的實驗條件下進(jìn)行目標(biāo)化合物的回收率試驗，樣液經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表4。可見，該方法的回收率較高，5.00、10.0、50.0 μg·kg-1添加水平的回收率范圍分別為82.8%～94.6%、87.1%～94.0%、90.0%～99.2%，均符合相關(guān)要求。而且該方法操作簡單，檢出限低、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，峰形穩(wěn)定，能滿足殘留分析的要求，適用于動物源性食品中二硝托胺的檢測分析。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性參數(shù)

表4 方法加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié) 論

本方法以O(shè)asis PRiME HLB固相萃取柱“上樣-洗脫”2 步法凈化，建立了動物源性食品中二硝托胺殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。結(jié)果顯示，該方法操作簡單、快捷，方法檢出限低、回收率高、靈敏度好。能有效去除復(fù)雜肉類樣品中蛋白質(zhì)、油脂等引起的基質(zhì)干擾，延長色譜柱的使用壽命，降低對質(zhì)譜儀的污染，適用于動物源性食品中二硝托胺的準(zhǔn)確定性、定量檢測。