爬山虎果實中原花青素提取工藝優化

謝文杰,張 磊,胡璐曼,駱麗如,曾澤南,唐忠海

(湖南農業大學食品科學技術學院,湖南長沙 410128)

爬山虎(ParthenocissustricuspidatePlach)又名“地錦”、“爬墻虎”,為葡萄科多年生落葉藤本植物。其根、莖可入藥,能破瘀血、消腫毒[1],成熟的果實為紫黑色球形漿果[2],富含原花青素[3-4]。

花青素(Anthocyanidin),又名花色素,為3,5,7-三羥基-2-苯基苯并吡喃陽離子結構,是一種廣泛存在于自然界植物中的水溶性天然色素,同時也是構成花瓣和果實顏色的主要色素之一,屬于黃酮類化合物。花青素這個名稱是Marquart在1835年給車矢菊花朵中提取出的藍色物質命名的時候提出來的,并且沿用至今現在為同類物質的統稱[5]。原花青素是植物中廣泛存在的一類多酚化合物的總稱,具有抗氧化、抗炎癥、抗過敏、增強機體免疫力、維持正常視覺、抗熱應激、清除機體自由基、降低血脂以及預防心血管系統疾病等重要生理調節功能[6-8]。原花青素色澤純正、食用安全、益于人體健康,主要用于食品工業、藥品制造和化妝品生產等領域[7,9-10]。另有研究證實,原花青素能夠有效防治包括心臟病、關節炎等在內的80多種由體內自由基所引起的疾病;能夠有效防止食品在貯藏、運輸等過程的氧化變質,尤其是油脂和富脂食品的酸敗;此外,原花青素還具有抗菌、抗腫瘤、防糖尿病、防腹瀉、促進生長、益智健腦、減輕疲勞、延緩衰老和抗輻射損傷等重要的生物學功能[11-14]。

目前所利用的原花青素主要來自葡萄籽及海松皮提取物[15],對葡萄、海松樹等單一資源的依賴嚴重制約了我國原花青素產業的發展[16]。而我國爬山虎資源豐富,品質天然、無污染,是提取原花青素的重要潛在資源物質[17]。如能有效綜合開發與利用我國豐富的爬山虎資源,對提升我國原花青素產業的國際競爭力有重要意義。

本研究通過單因素試驗考察了提取溫度、提取時間、液料比和乙醇體積分數對爬山虎果實中原花青素得率的影響;通過響應面法進行優化,以期得到爬山虎果實中原花青素的最佳提取工藝,為爬山虎的綜合開發與利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

爬山虎果實 由湖南省林產化工工程重點實驗室提供,采自吉首大學張家界校區后山(經測定為葡萄科爬山虎屬植物爬山虎);甲醇、香草醛、石油醚、氫氧化鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;無水乙醇 分析純,廣東市光華化學廠;濃鹽酸 分析純,衡陽市凱信化工試劑有限公司;乙酸乙酯 分析純,天津市恒興化學試劑制造有限公司。

微型植物粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司;KQ-A玻璃儀器氣流烘干器 北京中興科學儀器公司;HH.S11-4型數顯電熱恒溫水浴鍋 上海嵐洋自動化系統工程有限公司;DHG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精密實驗設備有限公司;RE-2000型旋轉蒸發儀 鄭州長城科工貿有限公司;SHB-II多用循環水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;紫外-可見分光光度檢測器:Agilent8453;AUW220D精密電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;真空冷凍干燥器。

1.2 實驗方法

1.2.2 原花青素提取工藝路線 脫脂后的干爬山虎果實粗粉→乙醇回流提取→抽濾→濾液減壓濃縮→烘干(47 ℃ 20 h)→水溶解除雜→抽濾→石油醚萃取(石油醚∶抽濾后的原料=1∶1,30 min)→分離醚相,將石油醚水浴揮發出來→乙酸乙酯萃取(乙酸乙酯∶水浴后的原料=1∶1,30 min)→加蒸餾水揮去乙酸乙酯→預凍(-80 ℃,1 h)→真空冷凍干燥(-80 ℃)→原花青素粉末[18-19]。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 提取溫度對原花青素得率的影響 稱取7組,每組3.0 g的脫脂后的果實粗粉,溶解在體積分數為70%的乙醇溶液中,控制液料比為20∶1 mL/g,調整pH至5.0[21];置于恒溫水浴鍋中,分別在30、40、50、60、70、80、90 ℃下提取1 h;平行三次。測定并計算原花青素得率。

1.2.3.2 提取時間對原花青素得率的影響 稱取7組,每組3.0 g的脫脂后的果實粗粉,溶解在體積分數為70%的乙醇溶液中,控制液料比為20∶1 mL/g,調整pH至5.0;置于恒溫水浴鍋中,在70 ℃恒溫條件下,分別提取30、50、70、90、110、130、150 min;平行三次。測定并計算原花青素得率。

1.2.3.3 乙醇體積分數對原花青素得率的影響 稱取6組,每組3.0 g的脫脂后的果實粗粉,溶解在體積分數分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液中,控制液料比為20∶1 mL/g,調整pH至5.0;置于恒溫水浴鍋中,在70 ℃恒溫條件下提取1 h;平行3次,測定并計算原花青素得率。。

1.2.3.4 液料比對原花青素得率的影響 稱取6組,每組3.0 g的脫脂后的果實粗粉,溶解在體積分數為70%的乙醇溶液中,控制液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g,調整pH至5.0;置于恒溫水浴鍋中,在70 ℃恒溫條件下,提取1 h;平行3次,測定并計算原花青素得率。

1.2.3.5 重復提取次數對原花青素得率的影響 稱取4組,每組3.0 g的脫脂后的果實粗粉,溶解在體積分數為70%的乙醇溶液中,控制液料比為20∶1 mL/g,調整pH至5.0;置于恒溫水浴鍋中,在70 ℃恒溫條件下,提取時間1 h,分別提取1、2、3、4次;平行三次。測定并計算原花青素得率。。

在農作物的生長過程中，不單單只有土壤以及肥料會對農作物的產量造成影響，同時其相關的種植模式也會對其生長造成一定的影響。就比如，在選擇農作物的種類進行種植時，如果不能充分的考慮農作物的間套種植，那么其相關的光溫及肥料的吸收和利用率就必然會受到嚴重的影響。因此農業工作人員一定要選擇科學合理的種植模式，不能單單只是進行一種農作物的種植，進而對土地進行充分的利用。

1.2.4 提取工藝條件的響應面法優化試驗 綜合單因素實驗及正交試驗結果,選取對原花青素得率影響較大的4個因素,即:提取溫度、提取時間、乙醇體積分數和液料比,分別以X1、X2、X3和X4表示(表1)。以X1、X2、X3和X4為自變量,以原花青素得率為響應值(Y)進行試驗。采用Design-Expert 7.0對實驗數據進行回歸分析。每一自變量的低、中、高實驗水平分別以-1、0、1進行編碼。

表1 響應曲面設計實驗因素水平和編碼Table 1 Independent variables and their levelsused in the response surface design

1.2.5 原花青素含量測定 原花青素含量的測定采用香草醛-鹽酸比色法[20]

1.2.5.1 原花青素標準曲線的制作 分別取1 mg/mL原花青素標準液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于10 mL具塞容量瓶中,依次加入6 mL A液(4%香草醛甲醇溶液),3 mL B液(濃鹽酸),用甲醇定容至10 mL,搖勻;空白對照為A液∶B液∶甲醇=6∶3∶1 (V∶V∶V)。30 ℃避光水浴20 min,反應期間輕輕晃動數次。反應結束后,冷卻至室溫,搖勻,用Agilent8453紫外分光光度計,測520 nm處吸光值。以原花青素濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.5.2 樣品中原花青素含量測定 取1 mL甲醇復溶后的原花青素樣品按照上述方法進行反應,反應結束后用Agilent8453紫外分光光度計,測520 nm處吸光值。根據標準曲線計算樣品中原花青素濃度,并利用下式計算原花青素得率:

其中,C為測得的原花青素濃度,mg/mL;V為樣品定容體積mL;n為樣品稀釋倍數;m為干爬山虎果實粗粉質量mg。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

如圖1所示,標準曲線回歸方程為y=6.7592+0.0283(R2=0.9984)。結果表明,原花青素在0.01～0.06 mg/mL范圍內與520 nm處吸光值線性關系良好。

圖1 原花青素標準曲線Fig.1 Standard curve of proanthocyanidins

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 提取溫度對原花青素得率的影響 如圖2所示,在30～70 ℃范圍內,原花青素得率隨著溫度升高而增大,超過70 ℃后,原花青素得率卻隨著溫度的升高而降低,這是由于原花青素極易氧化,溫度越高,原花青素有效成分的結構被破壞的程度就越大,活性成分損失的就越多。并且高溫下固體原料本身會起化學變化,使雜質溶出增多,因而會降低原花青素得率。

圖2 提取溫度對原花青素得率的影響Fig.2 Effect of different extractiontemperature on extraction rate

2.2.2 提取時間對原花青素得率的影響 由圖3可知,提取時間為30～70 min時,原花青素得率隨著時間增加而增大,70 min處達到最大值;之后隨提取時間的延長,原花青素得率開始逐漸下降。提取時間過短,原花青素來不及溶出,提取時間過長,酚類物質易被破壞[22]。

圖3 提取時間對原花青素得率的影響Fig.3 Effect of different extraction time on extraction rate

2.2.3 乙醇體積分數對原花青素得率的影響 如圖4可知,當乙醇體積分數為40%～70% 時,隨著乙醇濃度增大,原花青素得率相應增加;當乙醇體積分數達到60%時,提取量也達到最高值。當乙醇體積分數大于60%時,原花青素得率開始下降。這是由于乙醇濃度不同,浸提溶劑極性大小不同,因此其對原花青素的溶出效果有不同影響。原花青素是一種多酚類物質,含較多羥基且具有一定極性,依據相似相溶的原理,當溶劑極性和原花青素極性相當時,溶解度達到最大,同時,得率最多,隨著乙醇濃度進一步增加,其中,一部分醇溶性成分溶出,同原花青素競爭與乙醇的結合,會導致原花青素提取得率下降[23]。因此選擇合適的醇/水比例尤為關鍵。

圖4 乙醇體積分數對原花青素得率的影響Fig.4 Effect of different ethanol concentration on extraction rate

2.2.4 液料比對原花青素得率的影響 由圖5可知,液料比在5∶1～15∶1 mL/g范圍內,原花青素得率隨著溶劑的增加而增加。在15∶1～30∶1 mL/g內原花青素得率增加緩慢。在實際生產中,如果液料比較大,不僅會消耗較多的溶劑,而且會降低原花青素的濃度,在后續的操作過程中需要消耗更多的能源,因而,液料比取15∶1較好。

圖5 液料比對原花青素得率的影響Fig.5 Effect of different solid to liquid ratio on extraction rate

2.2.5 重復提取次數對原花青素得率的影響 由圖6可知,提取次數的增多能增加提取總量。提取1次以后,材料中原花青素得率明顯降低;提取2次之后,材料中原花青素得率已經很低了,提取3次之后,材料中原花青素得率已經接近零了。綜合考慮到能源消耗、設備占用和勞動力成本,提取1次較好。

圖6 重復提取次數對原花青素得率的影響Fig.6 Effect of different extract times on extraction rate

2.3 響應面實驗結果與分析

2.3.1 響應面法優化原花青素提取工藝 根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理,綜合單因素試驗結果,選取對原花青素得率影響較大的4個因素,即:提取溫度、提取時間、乙醇體積分數和液料比,分別以X1、X2、X3和X4表示。試驗因素和水平設計見表1。以X1、X2、X3和X4為自變量,以爬山虎果實原花青素得率為響應值(Y)進行試驗。試驗方案及結果見表2。表2共27個試驗點,其中7、11、14是中心試驗,其余為析因試驗。析因點為自變量取值在X1、X2、X3和X4所構成的頂點,零點為區域的中心點,其中零點試驗重復3次,用以估算試驗誤差。

表2 響應面分析法結果Table 2 Results of response surface analysis

2.3.2 模型的建立與顯著性檢驗 采用Design-Expert 10對所得的實驗結果進行多元回歸分析,分析結果見表3。由于各因素對原花青素的得率的影響不是簡單的線性關系,為了明確各因子對相應值的影響,使用Design Expert 10,對表3中原花青素得率進行回歸擬合,獲得二次多項回歸方程:

從表3的分析結果來看,模型的P值小于0.0001,表明該二次方程模型達到極顯著水平;失擬項0.6999遠遠大于0.05,表明該項不顯著,由此可說明該方程對試驗擬合較好,自變量與響應值之間線性關系良好,可以用于原花青素得率的理論值的預測。

表3 回歸分析結果Table 3 Results of variance analysis

由表3可知,提取溫度、乙醇體積分數的一次項,提取溫度、提取時間與乙醇體積分數的二次項,提取溫度與提取時間交互項,提取溫度與乙醇體積分數交互項均達到高度顯著水平P<0.0001;液料比的一次項,乙醇體積分數與液料比的交互項達到極顯著水平(P<0.01);液料比二次項,提取溫度與液料比的交互項達到顯著水平(P<0.05)。由F值可知,各因素對原花青素得率的影響次序為:提取溫度>乙醇體積分數>液料比>提取時間。

2.3.3 交互作用分析 從Design Expert10軟件中可得到各因素X1、X2、X3、X4對響應值原花青素得率Y所構成的三維空間曲面圖,用來反映各因素與響應值之間的影響作用。曲面越陡峭,表示變化越急劇,作用越明顯,曲面顏色也呈加深趨勢。交互效應強弱程度可從等高線的形狀中觀察,圓形為交互作用不顯著,橢圓則為交互作用顯著[24]。此外,在一定范圍內,等高線圖中等高線的疏密或條數也是判斷交互作用顯著與否的一個重要標準[25]。

從圖7a～圖9a,圖12a中可以看出,曲面傾斜度比較大,且越接近曲面頂端時,顏色愈深,說明相關兩因素間交互作用對響應值的影響顯著。而圖10～圖11中曲面的變化相對平緩,說明相關兩因素間交互作用對響應值的影響不明顯。

圖7 提取溫度與提取時間對原花青素得率影響的響應面圖Fig.7 Response surface plots of extraction temperature and extraction time on the proanthocyanidin extraction rate

圖8 提取溫度與乙醇體積分數對原花青素得率影響的響應面圖Fig.8 Response surface plots of extraction temperature and concentration of ethanol on the proanthocyanidin extraction rate

圖9 提取溫度與液料比對原花青素得率影響的響應面圖Fig.9 Response surface plots of extraction temperature and material quality concentration on the proanthocyanidin extraction rate

圖10 提取時間與乙醇體積分數對原花青素得率影響的響應面圖Fig.10 Response surface plots of extraction time and concentration of ethanol on the proanthocyanidin extraction rate

圖11 提取時間與液料比對原花青素得率影響的響應面圖Fig.11 Response surface plots of extraction time and material quality concentration on the proanthocyanidin extraction rate

圖12 液料比與乙醇體積分數對原花青素得率影響的響應面圖Fig.12 Response surface plots of material quality concentration and concentration of ethanol on proanthocyanidin extraction rate

從圖7b～圖9b,圖12b可以看出,各圖等高線基本接近橢圓形,故相關兩因素之間均存在交互作用。以圖9b為例,取提取溫度X1的三個水平進行等高線圖分析。在-1到0之間時,等高線條數明顯多于0到1之間,且越接近0水平,等高線越稀疏,相鄰等高線之間跨度越大;在0到1之間,等高線條數僅為1條。結果表明,一定范圍內,等高線越密集,曲面變化率越小,交互作用對響應值的影響越不顯著。反之,等高線越稀疏,則表示交互作用對響應值的影響越顯著。

2.3.4 最佳提取工藝條件的確定 結合回歸模型的數學分析可知,乙醇回流法提取爬山虎果實原花青素的最佳工藝參數為:提取溫度75.87 ℃,提取時間74.12 min,乙醇體積分數55.71%,液料比20∶1。在此工藝條件下爬山虎果實原花青素的理論得率為3.8166%。為檢驗RSA法的可靠性,采用上述最佳提取條件進行驗證試驗。考慮到實際操作條件,將最佳提取條件修正為:提取溫度76 ℃,提取時間74 min,乙醇體積分數56%,液料比20∶1,實際測得的原花青素得率為3.8214%±0.2287%,稍高于理論預測值3.8166%。此結果說明實際實驗值與軟件預測值吻合度良好,證明此優化方案可行,在實際應用中具有可操作性。

3 結論

單因素實驗以提取溫度、提取時間、乙醇體積分數、液料比和重復提取次數為單因素,采用乙醇回流提取法考察其對原花青素得率的影響。結果表明,這幾個因素對原花青素得率都有明顯影響。結合單因素結果,本研究采用響應面分析法進一步優化爬山虎果實中原花青素的提取工藝研究,以提取溫度、提取時間、乙醇體積分數和液料比為主要因素進行中心組合試驗,建立了原花青素含量預測方程。實驗結果表明,提取溫度、乙醇體積分數的一次項,提取溫度、提取時間與乙醇體積分數的二次項,提取溫度與提取時間交互項,提取溫度與乙醇體積分數交互項均達到高度顯著水平(P<0.0001);液料比的一次項,乙醇體積分數與液料比的交互項達到極顯著水平(P<0.01);液料比二次項,提取溫度與液料比的交互項對響應值的影響達到顯著水平(P<0.05)。當提取工藝條件為提取溫度76 ℃,提取時間74 min,乙醇體積分數56%,液料比20∶1,提取1次時,原花青素含量達到極大值3.8214%,與理論預測值接近。說明響應面分析法優化爬山虎果實中原花青素的提取工藝可行。