方格星蟲纖溶酶抗血栓作用研究

黃曉亮,李福森,陳銘潔,謝國濤,蒙湄方,李映新

(廣西醫科大學藥學院,廣西南寧 530021)

方格星蟲(Sipunculusnudus)亦稱光裸方格星蟲,俗稱“沙蟲”,為星蟲動物門(Sipuncula)、星蟲綱(Sipunculidea)、方格星蟲屬(Sipunculus),其中以廣西北部灣海域的自然資源最豐富。方格星蟲營養豐富、肉質脆嫩、鮮美甘甜,有滋陰降火之功效,東南沿海居民稱其為“海洋冬蟲夏草”,具有藥食兩用的價值[1-3]。過去國內外研究方格星蟲主要集中在生長、生殖、生理、生態等方面,藥用價值的研究較少,但近幾年來,關于其有效成分及藥理作用的報道也逐年增加。目前主要發現方格星蟲富含多糖、多肽等成分,具有抗疲勞、抗氧化、抗病毒、提高免疫力等藥理活性[4-5]。

方格星蟲纖溶酶(SNFE)是本課題組從方格星蟲內臟中提取分離的一種絲氨酸蛋白酶(專利號:ZL201010210919.5),相對分子質量33.25 kD,在對其開展的一系列研究中發現,SNFE兼具激酶及直接溶解纖維蛋白的活性,在體外具有良好的溶栓和抑制二磷酸腺苷(ADP)誘導的血小板聚集作用,在體內能延長小鼠的出血時間和凝血時間,顯示其在抗血栓方面具有良好的研究和應用前景[6-8]。

角叉菜膠誘導的鼠科動物血栓模型是研究抗栓藥物常用的一種動物模型,利用角叉菜膠強烈的致炎作用刺激炎癥因子釋放從而損傷血管內皮細胞,進而破壞正常血管內皮維持凝血和纖溶的動態平衡的功能引發血栓[9-10]。該實驗操作相對簡單,且血栓出現在尾部,易于觀察和測量,適合對血栓形成或者溶解過程的動態觀察[11-12]。

本文通過在體外測定SNFE對花生四烯酸(AA)誘導的血小板聚集的抑制率,在體內建立角叉菜膠誘導的小鼠靜脈血栓模型,觀察SNFE對黑尾發生率、黑尾相對長度以及對凝血四項指標,即血漿凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)以及纖維蛋白原(FIB)的影響,初步評價SNFE的抗血栓用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

8周齡SPF級SD大鼠(體重(200±20) g,雌雄不限)、4周齡SPF級昆明小鼠(體重(20±2) g,雄雌各半) 動物生產許可證:SCXK(桂)2014-0002,動物使用許可證:SYXK(桂)2014-0003,廣西醫科大學實驗動物中心提供;花生四烯酸(100 mg)、角叉菜膠(25 g) Sigma公司,阿司匹林腸溶片 亞寶藥業;凝血酶原時間(PT)測定試劑盒、活化部分凝血酶時間(APTT)測定試劑盒、凝血酶時間(TT)測定試劑盒、纖維蛋白原(FIB)測定試劑盒 上海太陽生物技術有限公司。

ME204E電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;560CA全血小板聚集儀 美國Chrono-Log公司;MC-100血凝儀 德國美創公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SNFE的提取及活性測定 提取方法參照文獻[6],酶活力測定按照纖維蛋白平板法,以尿激酶為對照,得到標準曲線,Y(溶酶圈面積)=0.0012X(酶活力)+0.5667(r=0.9986),根據標準曲線計算酶活力為50 IU/mg。SNFE凍干粉存于-20 ℃冰箱保存,臨用前根據實驗所需濃度用生理鹽水配制使用。

1.2.2 SNFE對花生四烯酸誘導血小板聚集的影響 大鼠麻醉后腹主動脈采血,全血用枸櫞酸鈉抗凝并以800 r/min離心10 min,吸取上層血漿為富血小板血漿(PRP),繼續以3000 r/min離10 min,取上層液為貧血小板血漿(PPP)。在測試杯中加入攪拌珠、280 μL的PRP及高、低濃度的10 μL SNFE溶液;陽性對照組以等體積的阿司匹林溶液(0.50 mg/mL)加入;空白對照組以等體積的生理鹽水加入。孵育3 min后,放入測試通道,加10 μL的花生四烯酸(AA)至終濃度為0.2 mmol/L,PPP調零并用血小板聚集儀測定空白對照管和給藥管血小板5 min內的最大聚集率(PAGM),每個濃度設5管平行對照。并按下述公式計算藥物對血小板聚集的抑制率(AIP)。

AIP(%)=(PAGM空白對照組-PAGM給藥組)/PAGM空白對照組×100

1.2.3 SNFE對角叉菜膠誘導血栓的影響 小鼠適應性飼養3 d后,隨機分成空白組、模型組、阿司匹林組(10 mg/kg)、SNFE低劑量組(4000 IU/kg)、SNFE高劑量組(8000 IU/kg),每組10只。除給藥組外,空白組和模型組給予生理鹽水,按照0.2 mL/10 g的容積每天上午灌胃給藥一次,每7 d稱體重一次并調整給藥量。灌胃第12 d,除空白組外,腰背部皮下按照0.1 mL/10 g注射0.8%角叉菜膠。繼續給藥2 d,在此期間觀察造模后24及48 h形成黑尾情況(尾靜脈血栓造模成功的判定方法:尾部形成暗紅色血栓),記錄形成黑尾的小鼠只數,并用直尺測量鼠尾長度及血栓的長度(從鼠尾末端到形成暗紅色血栓前沿的長度),按照血栓形成相對長度=尾部血栓長度/鼠尾長度,計算小鼠血栓形成相對長度。末次藥后2 h行拔眼球采血0.5～0.8 mL,用3.8%枸櫞酸鈉抗凝(9∶1)處理,3000 r/min 離心15 min,取上層血漿。按照試劑盒說明,采用全自動血凝儀測定血漿凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)及纖維蛋白原(FIB)。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 SNFE對花生四烯酸誘導血小板聚集的影響

AA途徑是血小板聚集的三個途徑之一,表1結果表明,與空白組比較,SNFE高、低劑量組均能降低AA誘導的血小板5 min內最大聚集率,且高劑量組的差異有統計學意義(P<0.01),低劑量組SNFE雖然也有抑制作用,但效果不顯著,說明SNFE和納豆激酶一樣[11],對AA誘導的血小板聚集的抑制作用具有一定量效關系。環氧化酶抑制劑阿司匹林直接阻斷AA途徑,效果最為顯著,高于SNFE組的抑制效果(P<0.01),推測可能是因為SNFE對AA途徑的作用是間接作用而非直接作用。

表1 SNFE對AA誘導血小板聚集率的影響(n=5)Table 1 Effect of SNFE on plateletaggregation induced by AA(n=5)

2.2 SNFE對角叉菜膠誘導的小鼠尾靜脈血栓的影響

注射角叉菜膠24 h后,僅個別小鼠尾巴尖部開始有約0.3～0.5 cm暗紅色血栓形成,大部分小鼠沒有黑尾出現,故未做統計。48 h后,注射角叉菜膠的各組大部分均出現從尾尖到尾根延伸的不同長度黑尾,界限明顯,通過直尺直接體表測量可知血栓長度。其中模型組和SNFE低劑量組的黑尾發生率(即每組發生黑尾的小鼠只數/每組小鼠總只數)為90%,SNFE高劑量組的黑尾發生率降低至60%;模型組的黑尾相對長度最長,SNFE高、低劑量組均有不同程度降低,但僅高劑量組有統計學差異(P<0.05),結果見表2。

表2 SNFE對角叉菜膠誘導的血栓形成的影響(n=10)Table 2 The effect of SNFE on carrageenaninduced tail-thrombus mice(n=10)

2.3 角叉菜膠致血栓小鼠凝血功能的影響

造模48 h后,模型組小鼠的PT、APTT、TT縮短,與空白組比較,有顯著差異(P<0.05);模型組FIB含量增加,但與空白組比較無顯著差異(P>0.05)。SNFE高、低劑量組的PT、APTT、TT在數值上均比模型組增加,FIB含量減少,但僅高劑量組的APTT、TT的延長有統計學意義(P<0.01或0.05);與空白組比較,SNFE各劑量組APTT以及高劑量組TT無顯著差異(P>0.05),說明SNFE可以使血栓小鼠的部分凝血功能指標恢復正常水平,結果見表3。

表3 SNFE對角叉菜膠致血栓小鼠凝血功能的影響(n=10)Table 3 Effect of SNFE on the blood coagulation function of carrageenan-induced thrombosis mice(n=10)

2.4 對小鼠體重的影響

如表4,喂養14 d內,各組小鼠飲食及活動均正常,無死亡,平均體重均處于逐日增長的狀態。實驗分組前,各組小鼠體重無顯著差異(P>0.05);喂養7 d后的SNFE高劑量組與同期空白組、模型組的體重比較顯著增加(P<0.05)。14 d后的SNFE各組小鼠體重均比同期空白組、模型組的體重顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)增加,說明SNFE對小鼠有增加體重的作用,其機理有待研究。

表4 SNFE對小鼠體重的影響(n=10)Table 4 Effects of SNFE on weights of mice(n=10)

3 討論與結論

血栓是血液成分在流動過程中,在血管或心臟內膜表面形成一種半凝塊狀物質,由不溶性纖維蛋白、沉積的血小板、積聚的白細胞和陷入的紅細胞組成。在可變的流體依賴型中,血栓血液中存在相互拮抗的凝血系統和纖維蛋白溶解系統(即抗凝血系統)。在正常的生理狀態下,凝血系統和抗凝血系統保持著動態平衡,即保證血液有潛在的凝固性又保證了血液的流體狀態。但是,當在某些因素作用下,打破了凝血系統和抗凝血系統的動態平衡,觸發了凝血過程,血液便在心血管腔內凝固,從而形成血栓[12]。因此,血栓的形成與凝血系統和纖維蛋白溶解系統密切相關,許多抗血栓藥物不是具備抗凝血作用,便是具有纖維蛋白溶解活性,而血小板的活化、黏附、聚集是血栓形成的重要步驟[13]。因此,本文首先研究SNFE在體外對花生四烯酸(AA)誘導血小板聚集的抑制作用,繼而建立血栓模型,測定SNFE對凝血系統的影響。

花生四烯酸(AA)是除了ADP外常用的血小板聚集誘導劑,它經環氧化酶途徑在血栓素合成酶作用下生成的代謝產物血栓素A2(TXA2)是血小板強烈的促聚劑[14],而阿司匹林可通過抑制血小板環氧化酶-1,抑制花生四烯酸的代謝,使TXA2生成減少而抗血栓。實驗結果顯示,SNFE在體外有抑制AA誘導的血小板聚集作用,但該作用弱于阿司匹林,估計是SNFE間接影響了AA代謝過程的某個環節,有待于后續實驗給予明確。

角叉菜膠誘導的鼠類血栓模型是研究抗血栓藥物常用模型,其疾病機理主要利用角叉菜膠的強致炎作用及鼠尾血液循環較差的特點,該實驗不需要進行手術從而避免對動物造成傷害,適用于飲食或預防性的血栓治療效果觀察[15-17]。在實驗中發現,溫度對模型成功與否有很大影響,使小鼠處于20 ℃的空調環境下,能夠容易形成血栓,而高溫不利于血栓出現,可能是由于低溫使尾部血液更易于循環不暢造成血栓。本實驗模型組黑尾發生率為90%,說明造模是成功的,但血栓在造模后48 h才明顯,根據文獻報道[18],濕度對模型成栓也有很大影響,本實驗成栓時間晚可能與實驗期間處于夏季高溫,環境濕度較小有關。SNFE高劑量組預防性給藥后造模,黑尾發生率和黑尾相對長度均比模型組降低,說明SNFE有一定的抑制血栓形成的作用。

為了探討抗血栓的作用機理,本實驗測定了凝血系統功能指標,凝血四項即PT、APTT、TT、FIB是檢測凝血系統功能是否正常最常用的敏感而重要的指標。PT和APTT分別反應外源性、內源性凝血系統狀況(凝血因子含量及活性改變);TT反應共同凝血途徑中,纖維蛋白原轉化為纖維蛋白的時間,由于纖維蛋白原的降解產物FDP能使TT延長,因此TT也作為纖溶系統的篩選實驗;FIB反應纖維蛋白原的含量,而纖維蛋白原是血液中含量最高的凝血蛋白,影響血液的黏度并作為凝血因子直接參與凝血過程[19]。本實驗中,SNFE高劑量組能使APTT、TT延長,甚至使模型小鼠的部分指標恢復正常水平,說明SNFE抑制角叉菜膠誘導的血栓形成作用與影響內源性凝血系統及延長纖維蛋白原轉化為纖維蛋白的時間有關。SNFE灌胃2周不僅沒有影響小鼠體重增長,反而增長比模型組及空白組快,具體機制還有待于實驗研究。

綜上所述,SNFE體外抑制AA誘導的血小板聚集并且預防性給藥能抑制角叉菜膠誘導的小鼠血栓形成,其作用機制與影響內源性凝血系統及延長纖維蛋白原轉化為纖維蛋白的時間有關,其他作用機制還有待于進一步深入探討。