2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的研發與應用

孟影，陳春峰，張小燕，沈維祥，郜恒駿

·新型冠狀病毒專欄·

2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的研發與應用

孟影，陳春峰，張小燕，沈維祥，郜恒駿

201203 上海，生物芯片上海國家工程研究中心

評價自主研發的針對 2019 新型冠狀病毒的多重核酸檢測試劑的性能指標及臨床驗證。

通過測試本試劑盒的準確性、靈敏度、特異性、精密度等指標，評估研發試劑盒的性能指標；同時，在臨床單位收集 60 例臨床樣本，統計本試劑盒對臨床樣本中 2019 新型冠狀病毒的檢出結果，并與診療指南推薦的確診/排除方法的結果進行比較，評估試劑在臨床檢驗中的適用性。

新研制的試劑盒各性能指標均符合要求：陽性符合率和陰性符合率均為 100%，對各陽性參考品和陰性參考品能夠準確檢出；靈敏度測試經過確認和驗證過程確定本試劑盒的最低檢測限濃度為 350 copies/ml；特異性測試顯示對具有潛在交叉可能的病原體和具有潛在干擾作用的藥物進行測試，檢出結果均正常，未受到交叉病原體和干擾物質的影響，特異性良好；精密度測試結果符合要求，批內精密度和批間精密度均 < 5%；對 60 例臨床樣本進行檢測，與參比方法相比，靈敏度為 95%（19/20），特異性為 100%（41/40），經分析和參比方法檢出結果差異不顯著（> 0.05）。

建立的 2019 新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒達到國內臨床診斷試劑所要求的主要性能指標，可以滿足臨床樣本的檢測，是一種快速、準確的檢測方法，可應用于臨床。

2019 新型冠狀病毒； 熒光PCR； 多重檢測； 性能評估

2019 年年底，武漢發生不明原因肺炎[1-2]，存在人傳人的現象，且在潛伏期同樣具有傳染性。2020 年 1 月 8 日，初步確認了新型冠狀病毒為此次疫情的病原，隨后病原體序列信息公布，世界衛生組織（WHO）收到中國疾控部門的基因譜數據，并將檢出的病毒命名為 2019-nCoV（2019 新型冠狀病毒）。2019-nCoV 屬于 β 屬的新型冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑 50 ~ 200 nm。S 蛋白是病毒的主要蛋白之一，其編碼基因用于病毒分型。N 蛋白包裹病毒基因組，可作為診斷抗原。2020 年 2 月 11 日，國際病毒分類委員會聲明，將新型冠狀病毒命名為“SARS-nCoV-2”[3]。

2020 年 1 月 10 日，上海公共衛生臨床中心聯同武漢中心醫院、華中科技大學、武漢市疾病預防控制中心、中國疾病預防控制中心、中國醫學科學院、悉尼大學等多家研究機構在 Virological.org、基因庫網站 GISAID 聯合公布了武漢不明肺炎感染病原體的基因序列[4]。GISAID 網站介紹稱新型冠狀病毒與蝙蝠中發現的某些冠狀病毒相似，但有別于此前發現的SARS/MERS 冠狀病毒[5]。

國家衛生健康委發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》（以下簡稱“診療方案”）中建議新冠病毒檢測時可同時收集上呼吸道（包括鼻咽和口咽）和下呼吸道（包括痰、氣管內吸出物或支氣管肺泡灌洗液）的標本，通過 RT-PCR 進行新冠病毒檢測。在下呼吸道樣本易于獲得的情況下（例如機械通氣的患者），臨床醫生可以選擇僅收集下呼吸道樣本。

本研究參照 WHO 發布《2019 新型冠狀病毒 RT-PCR 檢測指南》中推薦的檢測的靶標基因和 CDC 公布的靶標基因設計引物探針，單管檢測2 個靶標基因（新冠病毒基因、基因）和 1 個內標基因（人基因組 β-球蛋白基因），有效保證實驗結果的準確性，極大降低檢測的漏檢率和假陽性。同時本研究操作簡便，檢測迅速，檢出率高，操作過程無需開蓋，極大降低污染的可能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 臨床樣本 本研究所使用的 2019 新型冠狀病毒痰液樣本和咽拭子樣本由臺州恩澤醫療中心（集團）恩澤醫院提供；人類冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒均由中國科學院上海巴斯德研究所提供；肺炎支原體、百日咳桿菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、煙曲霉、白色念珠菌均由上海芯超醫學檢驗所提供。

表 1 測試核酸檢測系統交叉反應的病原微生物

1.1.2 假病毒顆粒 本研究性能評估所使用的假病毒顆粒由第三方機構采用本司提供的 SARS-CoV-2 陽性樣本核酸提取產物進行制備。

1.1.3 儀器 ABI7500 實時熒光定量 PCR 儀購自美國 Thermo Fisher 公司。

1.1.4 試劑 2019 新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒（RT-PCR 熒光探針法）為本公司自主研發，選擇 2019 新型冠狀病毒基因組相對保守的基因和基因作為擴增靶區域，設計特異性引物和探針，進行一步法 RT-PCR 擴增，通過熒光信號的變化，定性檢測人鼻咽拭子、口咽拭子、痰液、肺泡灌洗液樣本中是否含有新冠病毒。

臨床樣本提取采用本司獲證的 RNA 提取試劑盒。PCR 反應體系包含 5 × Neoscript RT Premix Buffer、25 × Neoscript RTase mix、0.2 μmol/L 引物和 0.1 μmol/L 檢測探針。將配制的 PCR 反應體系進行分裝，每個反應孔 10 μl，另加入 15 μl 的核酸模板，即可進行擴增檢測。

1.2 方法

1.2.1 熒光測定方法 將配制的 PCR 擴增反應液放置于熒光 PCR 儀上進行檢測，檢測程序：50 ℃ 20 min；95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 個循環，60 ℃收集熒光信號。根據熒光曲線Ct 值分析樣本的檢測結果。

1.2.2 靈敏度評價 選用第三方合成的 2019 新型冠狀病毒假病毒顆粒，根據定值濃度稀釋成系列濃度梯度，進行多次重復檢測，將具有 95% 陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢測限。在最低檢測限濃度水平選擇 3 例臨床樣本制備的假病毒顆粒進行驗證，每個樣本重復檢測 20 次，陽性檢出率應大于 95%。

1.2.3 特異性測試

1.2.3.1 交叉反應測試 通過對可能產生交叉反應的其他冠狀病毒、流感病毒、呼吸道疾病相關病原體等進行測試，相關病原微生物明細和濃度見表 1，評估本產品的分析特異性。

1.2.3.2 干擾測試 通過對可能產生干擾結果的內源性物質（如取樣過程中不可避免的出血）和外源性殘留物質（如各種治療藥物）進行測試（表 2），評估本產品的分析特異性。

表 2 干擾物質及其添加濃度

將上述干擾物質加入到弱陽性樣本和陰性樣本中，評估干擾物質是否對弱陽性樣本和陰性樣本的檢出產生干擾作用。

1.2.4 精密度評價 將假病毒顆粒和臨床樣本核酸提取物分別稀釋為中陽性水平樣本、弱陽性水平樣本、陰性樣本，每個樣本重復 2 次，每天上下午各進行一輪試驗，重復 20 d，評估試劑的批間和批內精密度。

1.2.5 準確性評價 對不同來源臨床樣本核酸提取物制備的陽性參考品和含有不同潛在交叉病原體的陰性參考品分別進行測試，評估試劑對陰陽性參考品檢出的符合率。

1.2.6 臨床樣本驗證 在臺州恩澤醫療中心恩澤醫院收集 60 例臨床樣本，以臨床確診方法作為對照方法，評估本試劑盒對臨床樣本檢測結果的準確性。

2 結果

2.1 靈敏度評價

將新型冠狀病毒制備的假病毒顆粒做系列梯度稀釋，分別稀釋至 3 × 105、3 × 104、3 × 103、3 × 102copies/ml，使用本試劑對上述濃度樣本進行多次重復檢測，結果表明當樣本濃度大于 3 ×103copies/ml 時，本試劑對各陽性樣本可達到 100% 的檢出率，樣本濃度為 3 × 102copies/ml 時試劑對各陽性樣本的檢出率達到 90%，略低于 95% 的陽性檢出限，因此進一步細化測試樣本的濃度范圍，以具有 95% 陽性檢出率的濃度為本試劑盒的最低檢出限。

使用本試劑進一步測試假病毒顆粒制備的系列濃度梯度樣本，濃度分別為 3 × 103、1 × 103、6 × 102、4 × 102、2 × 102copies/ml，每一濃度梯度樣本重復檢測 20 次，統計各濃度樣本檢出的陽性個數，結果見表 3。

表 3 各濃度樣本檢出情況列表

將上述數據進行統計，利用 Minitab 數據分析軟件得出具有 95% 陽性檢出率的濃度為350 copies/ml。同時將此濃度下的樣本再重復測試 20 次，結果全部檢出陽性，表明經過確認和驗證過程，本試劑的最低檢測限為 350 copies/ml。

2.2 特異性評價

2.2.1 交叉反應 使用本試劑對表 1 中的7 個病毒、2 個假病毒顆粒、8 個細菌、1 個人基因組進行檢測，檢出結果均為 2019 新型冠狀病毒陰性，無非特異性產生。

2.2.2 干擾反應 使用本試劑盒對表 2 中的7 種干擾物質進行測試，結果表明 2019 新型冠狀病毒弱陽性樣本檢出均為陽性，2019 新型冠狀病毒陰性樣本檢出均為陰性，結果正常，特異性良好。

2.3 精密度評價

使用 3 批次試劑，分別對臨床模擬樣本和臨床樣本從中陽性濃度水平、弱陽性濃度水平、陰性水平分別進行 20 天重復測試，經過計算，2019 新型冠狀病毒基因和基因在陰性水平檢出結果均為陰性，中陽性濃度水平和弱陽性濃度水平在批內、批間的精密度均小于 5%，說明本試劑盒具有良好的批內和批間精密度。

2.4 準確性評價

對企業制備的 5 個陽性參考品和 9 個陰性參考品分別進行測試，陽性參考品全部檢出 2019 新冠病毒陽性，陰性參考品檢出 2019 新冠病毒陰性，符合率 100%，說明本試劑準確性良好。

2.5 臨床樣本評價

按照統計學方法處理臨床驗證數據，將本次考核試劑與參比方法（臨床確認/排除方法）統計入表 4，進行配對四格表統計分析。經統計，60 份樣本中，本試劑盒檢測結果與確診結果相比，靈敏度達到 95.00%（75.13%，99.87%），特異性達到 100%（92.78%，100%），總符合率 98.33%（91.06%，99.96%），結果具有一致性。卡方檢驗結果顯示> 0.05，考核試劑與確診方法檢出結果差異不顯著，具有較好的臨床適用性。

表 4 臨床樣本檢測結果列表

檢測結果中 1 例樣本存在檢出差異，考核試劑檢出陰性，確診方法判斷為陽性，導致結果差異的原因可能是由于①取樣位置和取樣方法的差異，導致所取樣本中新型冠狀病毒滴度較低；②感染進程的差異，在感染的后期，病毒向下呼吸道轉移，上呼吸道采集的樣本病毒滴度較低，導致結果出現假陰性；③樣本采集后未能立即檢測，保存的條件不符合要求，導致樣本內的病毒 RNA 降解，影響檢出結果。

3 討論

目前，2019 新型冠狀病毒的傳染性較高，截至 2020 年 4 月 7 日凌晨全球新冠肺炎確診病例，達到 1 312 628 例，累計死亡病例 72636 例，多個國家呈現爆發式增長以及二次暴發的可能。目前對于新冠病毒的確診方法較為復雜，需要進行多方面的臨床表現及檢測結果的結合。首先綜合流行病學史和臨床表現判斷是否為疑似病例，若為疑似病例同時具備下述病原學或血清學證據之一者，即可確診為新型冠狀病毒感染[6-7]：①實時熒光 RT-PCR 檢測新型冠狀病毒核酸陽性；②病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源；③血清新型冠狀病毒特異性 IgM 抗體和 IgG 抗體陽性；④血清新型冠狀病毒特異性 IgG 抗體由陰性轉為陽性或恢復期較急性期升高 4 倍及以上。在臨床檢測中，限于檢測的緊迫性、操作的便利性以及測試的準確性，常用 PCR 檢測結果作為最終的確定方法，因此核酸檢測試劑的靈敏度和特異性直接影響病患的診治結果。由于疫情的突發性，市售試劑均沒有經過完整的性能驗證以及臨床試驗驗證，試劑性能存在一定的缺陷，增加結果假陰性或假陽性的可能。

本試劑在研發過程中參照 CDC、WHO 公布的引物探針序列以及靶標位點的區域進行優化，最終選擇特異性檢測 2019 新型冠狀病毒的基因和基因的特異性序列，優化引物和探針從根本上提高試劑的特異性和靈敏度。性能評估過程中，分別針對試劑的準確性、靈敏度、特異性、精密度、臨床樣本驗證等方面進行測試，均達到良好的檢出效果。與目前臨床上推薦使用的確定/排除標準的檢出結果接近，可以滿足臨床的使用需求，具有較高的臨床適用性。

[1] Li Q, Guan X, Wu P, et al. Early transmission dynamics in Wuhan, China, of novel coronavirus-infected pneumonia. N Engl J Med, 2020, 382(13):1199-1207.

[2] Bajema KL, Oster AM, McGovern OL, et al. Persons evaluated for 2019 novel coronavirus - United States, January 2020. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2020, 69(6):166-170.

[3] Chinanews.cn. The novel coronavirus was named SARS-CoV-2 by the international committee on the classification of viruses. 2020-02-12. http://www.chinanews.com/gj/2020/02-12/9088314.shtml. (in Chinese)

中國新聞網. 國際病毒分類委員會將新型冠狀病毒命名為SARS-CoV-2. 2020-02-12. http://www.chinanews.com/gj/2020/02-12/ 9088314.shtml.

[4] Virological.org. Preliminary phylogenetic analysis of 11 nCoV2019 genomes, 2020-01-19. (2020-01-31). http://virological.org/t/preliminary- phylogene tic-analysis-of-11-ncov2019-genomes-2020-01-19/329.

[5] Meo SA, Alhowikan AM, Al-Khlaiwi T, et al. Novel coronavirus 2019-nCoV: prevalence, biological and clinical characteristics comparison with SARS-CoV and MERS-CoV. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2020, 24(4):2012-2019.

[6] National Health Commission of the People's Republin of China. COVID-19 diagnosis and treatment plan (trial seventh edition). 2020-03-03. http://www.nhc.gov.cn/yzygj/s7653p/202003/46c9294a7 dfe4cef80dc7f5912eb1989/files/ce3e6945832a438eaae415350a8ce964.pdf. (in Chinese)

中華人民共和國國家衛生健康委員會. 新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版). 2020-03-03. http://www.nhc.gov.cn/yzygj/s7653p/ 202003/46c9294a7dfe4cef80dc7f5912eb1989/files/ce3e6945832a438eaae415350a8ce964.pdf.

[7] World Health Organization. Clinical management of severe acute respiratory infection when novel coronavirus (??????2019-nCoV)?????? infection is suspected: interim guidance. 2020-01-28. https://apps.who.int/iris/ handle/10665/330893.

Development and clinical application of a novel nucleic acid detection reagent for SARS-nCoV-2

MENG Ying, CHEN Chun-feng, ZHANG Xiao-yan, SHEN Wei-xiang, GAO Heng-jun

National Engineering Center for Biochip, Shanghai 201203, China

To evaluate the performance and clinical validation of novel coronavirus 2019 multiple nucleic acid detection reagent.

The negative compliance rate, positive compliance rate, LOD, specificity, precision and other indicators were tested, and the performance indicators of the kit was evaluated. At the same time, 60 cases of pharyngeal swab samples were collected in hospital, and the detection results of novel coronavirus 2019 were compared with the results of the diagnosis/exclusion method recommended by the diagnostic guidelines, so as to evaluate the applicability of the reagent in clinical detection.

All the performance indicators of the newly developed kit meet the requirements: the positive compliance rate and the negative compliance rate were 100%, which indicates the positive reference and the negative reference can be accurately detected. LOD of the kit was 350 copies/ml. The specificity test showed that the pathogen and the drug were tested, and the test results were normal. The precision test results meet the requirements. The precision within batches and between batches is < 5%. Compared with the control method, the sensitivity was 95% (19/20) and the specificity was 100% (41/40). There was no significant difference in the detection results between the analysis and the control method (> 0.05).

The novel coronavirus 2019 (SARS-CoV-2) nucleic acid detection kit reaches the main performance indexes required by domestic clinical diagnostic reagents,which can be applied to clinical test.

SARS-CoV-2; Fluorescence PCR; Multiplex test; Performance evaluation

·協會之窗·

2020“聲音?責任”醫藥衛生界人大代表政協委員座談會召開

由中國醫藥行業 24 家協（學）會共同主辦的 2020 “聲音?責任”醫藥衛生界人大代表政協委員座談會（以下簡稱“座談會”）于 5 月 21 日首次采取“線上+線下”的形式召開。來自醫藥衛生界的近 45 位全國人大代表政協委員、省級人大代表政協委員在線出席了本次座談會。國家發展改革委、國家衛生健康委、財政部、工信部、商務部、科技部、國家藥監局、國家醫保局以及中醫藥局等部委相關職能部門領導及專家應邀在線觀摩會議。

醫藥衛生領域作為抗擊新冠肺炎疫情主力軍，科研人員刻苦鉆研，加快藥物、疫苗和創新療法研究；醫務人員以實際行動生動詮釋了“敬佑生命、救死扶傷、甘于奉獻、大愛無疆”的崇高精神，充分展現了新時代醫藥衛生工作者的精神風貌、職業操守、意志品質和應急能力。

在保障人民生命健康的征途上，依然任重道遠。因此今年座談會的主題確定為“構建中國優勢的，保障全民健康、維護國家安全的醫藥衛生大格局”，希望化危為機，進一步凝聚起全面推進醫療衛生體系改革，加速醫藥行業轉型升級，推動健康中國建設的共識和動力。

中國醫藥生物技術協會代表會員單位和分支機構向醫藥衛生屆兩會代表建言獻策，共提交了 7 份提案，包括：

◆關于做大做強生物醫藥產業，全面提高國家生物安全治理能力的建議

◆關于推動生物樣本庫建設，增強生物資源及研發能力安全的建議

◆關于有效落實藥品數據保護制度，鼓勵醫藥產業創新轉型升級的建議

◆關于加強基因編輯技術管理的建議

◆關于推動臨床實驗室自建項目（LDT）規范監管制度建設，促進精準醫學發展的建議

◆關于進一步加快體外診斷試劑臨床評價的建議

◆關于醫療機構臨床實驗室開展檢測服務需經第三方能力認證的建議

GAO Heng-jun, Email: xiaoyan_zhang@shbiochip.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.03.002

郜恒駿，Email：xiaoyan_zhang@shbiochip.com

2020-04-10