以KRAS為靶標的抗結腸癌藥物篩選系統的構建及應用

何劉軍，謝永麗，岑山，周金明

·論著·

以KRAS為靶標的抗結腸癌藥物篩選系統的構建及應用

何劉軍，謝永麗，岑山，周金明

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所免疫生物學室（何劉軍、謝永麗、岑山、周金明）；321004 金華，浙江師范大學生化學院現代制藥創新研究中心（謝永麗、周金明）

構建以 KRAS 為靶標的抗結腸癌藥物篩選系統，為抗結腸癌藥物篩選提供新的技術手段。

首先選取細胞系并確定系統的技術參數，構建以 KRAS 為靶標的抗結腸癌藥物篩選系統，設計實驗驗證篩選系統的有效性；而后將構建的篩選系統初步應用，篩選化合物庫 Z183593-L1200，并對篩選結果進行驗證，驗證篩選系統的可行性。

完成篩選系統構建后，通過篩選系統（in-cell Western blot）測得的 Hce8693 和 T47D 細胞的 KRAS 表達差異與普通 Western blot 一致，篩選系統測定的 siRNA 系統的敲低效率與普通 Western blot 亦一致，篩選系統的有效性得到初步驗證。篩選激酶抑制劑化合物庫 Z183593-L1200 后，選取活性最好的化合物 PF-04691502 進行驗證；濃度梯度實驗顯示，隨著 PF-04691502 濃度升高則 KRAS 胞內含量降低，KRAS 胞內含量對 PF-04691502 濃度呈梯度依賴性；細胞增殖實驗結果顯示 PF-04691502 對 Hce8693 細胞的半數有效濃度（IC50）為 3.546 μmol/L，進一步驗證了系統的可行性。

所構建的以 KRAS 為靶標的抗結腸癌藥物篩選系統具有一定有效性和可行性，能夠用于以 KRAS 蛋白為藥物靶點的藥物高通量篩選，為抗結腸癌的藥物研發提供了新的篩選方法。

高通量模型； 結腸癌； KRAS； 近紅外雙色激光成像系統

是一種原癌基因，長約 35 kb，位于12 號染色體，是基因（及）家族成員之一[1]?；罨谋砥どL因子受體（EGFR）蛋白通過募集生長因子受體結合蛋白 2（GRB2）結合鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEF）促進 KRAS 蛋白的核苷酸交換，使其轉化為活性 GTP 結合態?；罨?KRAS 會激活一系列的下游通路，尤其是 RAF/MEK/ERK 和 PI3K/AKT 通路，從而促進細胞分裂增殖和抑制細胞凋亡[2-3]?；虻募せ钔蛔兛梢种?KRAS 蛋白的 GTPase 酶活性，和野生型 KRAS 蛋白相比降低 GTP 水解活性 3 ~ 9 倍[4]，促使 KRAS 蛋白處于 GTP 結合活性構象，導致 KRAS 信號處于持續激活狀態，進而引起細胞增殖失控，導致癌變發生[5-6]，基因突變在腫瘤中廣泛存在，在胰腺導管腺癌、結直腸腺癌、肺腺癌等腫瘤中呈現高表達[7]，是重要的癌癥驅動基因[8-9]；在 30% ~ 40%結直腸癌中發現具有激活基因突變。使用等位基因敲除和敲入野生型或激活突變的結直腸癌細胞系研究表明，這些突變在腫瘤細胞生存和腫瘤進展中發揮重要的作用。突變可增強細胞增殖，抑制細胞凋亡，改變細胞代謝和腫瘤微環境[1, 6]。上述研究表明，降低 KRAS 的胞內含量能達到抑制結腸癌細胞生長和增殖的目的，將降低 KRAS 蛋白的胞內含量作為抗結腸癌藥物的研發策略具有可行性。

近紅外雙色激光成像系統（in-cell Western blot）在細胞內即可完成胞內蛋白含量測定，操作簡便，定量線性范圍廣，且適用于高通量篩選，相較于傳統的 Western blot 實驗具有突出的優勢；本研究旨在以 KRAS 蛋白的胞內含量作為篩選指標，以近紅外雙色激光成像系統為技術手段建立一個以 KRAS 為靶標的抗結腸癌藥物篩選系統，以便能夠從數量巨大的化合物實體庫中精準高效地獲得抗結腸癌的活性化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 Costar 低熒光 96 孔細胞培養板為美國 Corning 公司產品；鼠源抗 KRAS 抗體為中國臺灣Abnova 公司產品；兔源抗 β-Actin 抗體為武漢愛博泰克生物科技有限公司產品；IRDye800 cw 抗鼠熒光二抗和 IRDye800 cw 抗兔熒光二抗為美國LI-COR 公司產品；RPM1640 培養基、0.25% 胰蛋白酶、25 ml 細胞培養瓶、6 孔及 96 孔細胞培養板、Lipofectamine RNAiMAX Reagent 和 1 × PBS 緩沖液均為美國Thermo Fisher Scientific 公司產品；Hce8693 人盲腸腺癌細胞為廣州華拓生物科技有限公司產品；T47D 人乳腺導管癌細胞為美國ATCC 產品；RIPA 裂解液（強）和Cell counting kit8（CCK8）為上海碧云天生物技術有限公司產品；si-h-KRAS siRNA 敲低系統為廣州博銳生物科技有限公司產品；化合物庫 Z183593-L1200 為美國 Selleck Chemicals 公司產品；其他無機試劑均為國產分析純。

1.1.2 實驗儀器 Odyssay 近紅外雙色激光成像系統為美國 LI-COR 公司產品；平臥式搖床為海門其林貝爾儀器制造有限公司產品；電泳轉膜儀為美國Bio-Rad 公司產品；生物潔凈工作臺為北京泰奇凈設備有限公司產品；細胞培養箱為美國Thermo Fisher Scientific 公司產品；干式恒溫器為杭州奧盛儀器有限公司產品；EnSpire 2300 多功能酶標儀為美國PerkinElmer 公司產品；自動細胞計數儀為美國Countstar BioTech 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞傳代培養 將細胞用 1 ml 0.25% 胰蛋白酶消化 2 min，用 4 ml RPM1640 終止消化，首先按 1:5 傳至新的 25 ml 培養瓶；而后使用自動細胞計數儀測定細胞濃度，將細胞懸液稀釋成2 × 105/ml，混勻后，將細胞懸液加入96 孔板中，200 μl/孔（每孔細胞數 4 × 104個），勿劇烈晃動，與 25 ml 培養瓶一同放置于細胞培養箱中培養，培養條件 37 ℃、5% CO2。

1.2.2 細胞轉染 按每孔 100 μl 吸取無血清的 RPM1640 培養基至 1.5 ml 離心管 A，加入RNAiMAX Reagent 5 μl/孔，另取與轉染孔數量相等的 1.5 ml 離心管，每孔加入 100 μl 無血清的 RPM1640 培養基，以及 5 μl 的 siRNA，靜置5 min，然后將離心管中的混合液按 105 μl/管加入到已加入 siRNA 的離心管中，靜置 15 min，然后全部加入至 6 孔板中。

1.2.3 蛋白提取 將培養基吸出，用 1 × PBS 洗一遍，加入 RIPA 裂解液，冰上放置 20 min，加入5 × protein loading buffer，然后干式恒溫器，100 ℃加熱30 min，然后將樣品置于–20 ℃貯存。

1.2.4 Western blot 將樣品取出，組裝電泳裝置，加入蛋白樣品，10 μl/孔，進行電泳操作（S1：75 V，45 min；S2：110 V，45 min），電泳完成后進行轉膜（75 V，75 min），再用 5% 脫脂牛奶封閉1 h，1 × PBST 洗兩次，而后進行一抗孵育（鼠源抗 KRAS 抗體 1:2000 稀釋；兔源抗 β-Actin 抗體 1:2000 稀釋），4 ℃過夜孵育；1 × PBST 洗4 次，5 min/次；孵育二抗（IRDye800 cw 抗鼠熒光二抗 1:500 稀釋；IRDye800 cw 抗兔熒光二抗 1:500 稀釋），室溫孵育 1 h；1 × PBST 洗 4 次，5 min/次；利用 Odyssay 近紅外雙色激光成像系統掃描。

1.2.5 In-cell Western blot 將已長滿細胞的 Costar 低熒光 96 孔細胞培養板從培養箱中取出，加入 3.7% 的甲醛溶液，100 μl/孔，固定 25 min；而后加入 0.1% 的 Triton-X100 溶液，100 μl/孔，打孔 20 min；加入 0.1% FBS，100 μl/孔，封閉 1 h；用 1 × PBS 洗滌 2 次，5 min/次；孵育一抗（鼠源抗 KRAS 抗體 1:400 稀釋；兔源抗 β-Actin 抗體 1:1000 稀釋），4 ℃過夜孵育；1 × PBS 洗 4 次，5 min/次；孵育二抗（IRDye800 cw 抗鼠熒光二抗 1:500 稀釋；IRDye680 cw 抗兔熒光二抗 1:500 稀釋），室溫孵育 1 h；1 × PBS 洗 4 次，5 min/次；利用 Odyssay 近紅外雙色激光成像系統掃描。

1.2.6 IC50的測定及計算 將細胞傳代至 96 孔細胞培養板中，4 × 104/孔，24 h 后加入梯度稀釋的待測化合物在細胞培養箱中培養 24 h 后，加入 CCK8，10 μl/孔，然后細胞培養箱中放置 2 h，使用 EnSpire 2300 多功能酶標儀在波長 450 nm 處測量吸光度（450），而后將數據導出，進行初步處理。將濃度按照從小到大順序排列，實驗組吸光度除以對照組并換算成百分比；而后在 Graphpad prism 5.0 上作散點圖，橫軸為化合物濃度，縱軸為實驗組450數值與 DMSO 組比值的百分數，而后計算 IC50。

2 結果

2.1 構建以 KRAS 為靶標的抗結腸癌藥物篩選系統

2.1.1 確定藥物篩選系統的細胞系 基于實驗室現有的近紅外雙色激光成像系統，選取人結腸癌的一個細胞系Hce8693，其基因發生突變，同時在胞內呈高表達，且抑制 Hce8693 細胞胞內的 KRAS 含量能夠抑制細胞增殖[10]，細胞大小適中，貼壁生長，適用于近紅外雙色激光成像系統。

2.1.2 制定藥物篩選系統的大體流程 將 Hce8693 細胞傳代至 Costar 低熒光 96 孔細胞培養板中，培養24 h，然后每孔加入待篩選化合物（1 μmol/L），設置 1 個復孔，培養 24 h；經前處理后，通過近紅外雙色熒光報告系統檢測細胞胞內的KRAS 蛋白含量，而后對實驗結果進行驗證。

2.2 驗證以 KRAS 為靶標的抗結腸癌藥物篩選系統的有效性

2.2.1 利用不同細胞系間 KRAS 蛋白表達差異驗證篩選系統的有效性 由于目前沒有以降低 KRAS 蛋白胞內含量為研發策略的陽性藥，為了驗證篩選系統的可靠性，我們選取了人乳腺導管癌細胞 T47D 作為對照細胞，其相對低表達 KRAS[7]。首先，普通 Western blot實驗（圖 1A）及半定量分析（圖 1B）證明了 T47D 細胞相較于 Hce8693 細胞顯著低表達 KRAS，KRAS 蛋白胞內含量僅為 Hce8693 的 26%；篩選系統（in-cell Western blot）半定量分析結果（圖 1C、1D）表明，T47D 胞內的 KRAS 蛋白水平顯著低于 Hce8693 細胞，相當于 Hce8693 胞內的 23%。綜上所述，篩選系統的結果與普通 Western blot 實驗結果基本一致，表明篩選系統能夠較為準確地檢測 KRAS 在胞內含量的差異，鑒于傳統 Western blot 實驗的可信度，能夠初步驗證篩選系統的有效性。

2.2.2 siRNA 敲低系統驗證系統有效性 為了驗證篩選系統的有效性，我們構建了 KRAS 的 siRNA 系統（si-h-KRAS-1/2/3），首先借助于普通 Western blot 驗證 3 種 siRNA 的敲低效率（圖 2A），分析結果表明，si-h-KRAS-1 和 si-h-KRAS-3 的敲低效率較高，敲低效率分別為 65% 和 63%（圖 2B）；而后使用篩選系統檢測 si-h-KRAS-1 和 si-h-KRAS-3 的敲低效率（圖 2C），定量后的結果顯示，si-h-KRAS-1 和 si-h-KRAS-3 的敲低效率分別為 71% 和 58%（圖 2D）。綜上結果，普通Western blot 結果與篩選系統的驗證結果基本一致，篩選系統的有效性得到了進一步驗證。

圖 1 兩株 KRAS 差異表達的細胞驗證篩選系統有效性（A：普通 Western blot實驗結果；B：普通 Western blot 實驗蛋白定量；C：篩選系統實驗結果；D：篩選系統蛋白定量）

Figure 1 Verifying the availability of the screening system by two strains of KRAS differentially expressed cells (A: Results of general Western blot experiment; B: Protein quantification of general Western blot experiment; C: Experimental results of screening system; D: Protein quantitative map of screening system)

圖 2 構建siRNA 敲低系統驗證篩選系統的有效性（A：普通Western blot 實驗結果；B：普通Western blot 實驗蛋白定量；C：篩選系統實驗結果；D：篩選系統蛋白定量）

Figure 2 Establishing siRNA system to verify the availability of the screening system (A: General Western blot experimental results chart; B: Ordinary Western blot experimental protein quantification chart; C: Screening system experimental results graph; D: Screening system protein quantification graph)

2.3 篩選化合物庫驗證以 KRAS 為靶標的抗結腸癌藥物篩選系統的可行性

為進一步驗證以 KRAS 為靶標的抗結腸癌藥物篩選系統的可行性，利用篩選系統對激酶抑制劑化合物庫Z183593-L1200 中的 425 個化合物進行高通量篩選（圖 3），并選取降低 Hce8693 細胞胞內 KRAS 蛋白含量最為明顯的化合物 PF-04691502（KRAS 蛋白胞內含量抑制率 64%）（圖 4A）進行活性驗證并測定其 IC50。濃度梯度實驗結果顯示，隨著化合物 PF-04691502 濃度的提高，KRAS 的胞內含量不斷降低，與 PF-04691502呈濃度依賴關系（圖 4B、4C）。雖然在 PF-04691502 濃度為 1 μmol/L 時，對 KRAS 蛋白胞內含量抑制率僅為 43%，和初篩數據不相符，但仍表明PF-04691502 的篩選結果可信度較高；細胞增殖實驗結果經 Graphpad prism 5.0 作圖并計算而知，化合物 PF-04691502 對細胞 Hce8693 的 IC50為 3.546 μmol/L（圖4D）。以上實驗結果反映出化合物 PF-04691502 能有效降低 Hce8693 胞內KRAS蛋白含量，并能夠抑制細胞的生長和增殖；表明篩選系統可從化合物庫中篩選出降低結腸癌細胞內 KRAS 蛋白含量的活性化合物，篩選系統的可行性得到驗證。

圖 3 激酶抑制劑庫 LP1200 的篩選結果

Figure 3 Screening results of the kinase inhibitor library LP1200

3 討論

KRAS 在結腸癌等癌癥發生發展過程中是重要的驅動基因，目前以 KRAS 作為藥物靶標的研發策略主要包括：①減少 KRAS-GTP 的含量；②阻礙 KRAS-GTP 與下游效應因子的結合；③減少 KRAS-GTP 的膜錨定；④減少 KRAS-GTP 的二聚化和多聚化[11]。相比于上述四種研發策略，降低 KRAS 蛋白胞內含量這種研發策略成本最低，且研究人員進行了多次原理性驗證。Singh 等[12]采用shRNA 敲除研究表達 KRAS 蛋白的細胞系，發現這些細胞系分為兩類，KRAS 依賴組和 KRAS 非依賴組。KRAS 依賴組細胞系表達 E-cadherin 因子，對敲低 KRAS 蛋白的 shRNA 敏感。同時，多西環素誘導 KRAS 蛋白表達在小鼠實驗表明，誘導表達 KRAS 蛋白可以形成腫瘤，而停止誘導表達 KRAS 蛋白會使腫瘤變小并消失[13]。以降低 KRAS 蛋白胞內含量作為研究策略，阿斯利康開發了反義核苷酸 AZD4785。AZD4785 可有效抑制細胞中的 mRNA 和蛋白的表達，可選擇性抑制突變介導的下游因子通路以及突變細胞的增殖。小鼠體內實驗也證實 AZD4785 可以抑制 KRAS 突變細胞移植腫瘤以及患者來源移植腫瘤中的 KRAS 表達，抑制其腫瘤的生長。同時以小鼠和猴子為評價模型表明 AZD4785 可在一系列的組織中穩定下調目標蛋白 KRAS 的水平，并未表現任何副作用[14]。這些研究結果充分表明降低 KRAS 胞內含量在體內外均具較好的抑癌效果及安全性，更進一步佐證了以降低KRAS 的胞內含量為研發策略的可行性。

圖 4 驗證化合物 PF-04691502 對 Hce8693 的抑制活性（A：化合物 PF-04691502 的化學結構；B：普通 Western blot 實驗結果；C：普通 Western blot 實驗蛋白定量；D：細胞增殖實驗結果）

Figure 4 Verifying the inhibitory activity of compound PF-04691502 on Hce8693 (A: Chemical structure of compound PF-04691502; B: Normal Western blot results; C: Normal Western blot experimental protein quantitative map; D: Results ofcell proliferation test)

本研究初步建立以 KRAS 為靶標的抗結腸癌藥物篩選系統，通過設置陰性對照細胞和敲低胞內 KRAS 的方法驗證系統的有效性；后又篩選了化合物庫，并對篩選結果進行了初步驗證，結果表明該篩選系統具有一定可行性。綜上所述，該系統具有可行、有效、高通量的特征，為結腸癌的藥物研究提供了一種新的篩選方法，加快抗結腸癌藥物的研發。

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Construction and application of KRAS-targeted drug screening system against colon cancer

HE Liu-jun, XIE Yong-li, CEN Shan, ZHOU Jin-ming

Department of Immunobiology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (HE Liu-jun, XIE Yong-li, CEN Shan, ZHOU Jin-ming); Modern Pharmaceutical Innovation Research Center, School of Biochemistry, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China (XIE Yong-li, ZHOU Jin-ming)

To construct a KRAS-targeted drug screening system, providing a new technical means for screening anti-colon cancer drugs.

Firstly, the cell line was selected and the technical conditions of the system were determined. The screening system targeting KRAS was constructed, and the effectiveness of the screening system was evaluated. The screening system was then applied to screen the kinase inhibitor library Z183593-L1200. The screening results are verified to verify the feasibility of the screening system.

After the completion of the screening system, the difference in KRAS expression between Hce8693 and T47D cells measured by the screening system (in-cell Western blot) was consistent with that of the common Western blot. The knockdown efficiency of the siRNA system determined by the screening system was also consistent with that of the common Western blot. The effectiveness of the screening system was initially verified. After screening the compound library Z183593-L1200, the best activity compound PF-04691502 was selected for verification. The concentration gradient experiment showed that the intracellular content of KRAS decreased with the increase of PF-04691502 concentration, and the intracellular content of KRAS showed the concentration of PF-04691502. Gradient-dependent; cell proliferation assay showed that the half effective concentration (IC50) of PF-04691502 on Hce8593 cells was 3.546 μmol/L, further verifying the feasibility of the system.

The KRAS-targeted anti-colon cancer drug screening system has certain validity and feasibility. It can be used for high-throughput screening of drugs with KRAS protein as a drug target, and provides a new drug development for a screening method.

High-throughput model; Colon cancer; KRAS; In-cell Western blot

ZHOU Jin-ming, Email: zhou_jim@hotmail.com; CEN Shan, Email: Shancen@hotmail.com

國家自然科學基金（81672559）

周金明，Email：zhou_jim@hotmail.com；岑山，Email：shancen@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.03.005

2019-10-08