LncRNA NR2F2-AS1靶向抑制miR-129-5p調控膠質瘤細胞增殖和凋亡的機制研究

張大鵬，楊艷輝

·論著·

LncRNA NR2F2-AS1靶向抑制miR-129-5p調控膠質瘤細胞增殖和凋亡的機制研究

張大鵬，楊艷輝

453000 河南，新鄉市中心醫院神經外科（張大鵬）；453600 河南，輝縣市人民醫院超聲科（楊艷輝）

研究 lncRNA NR2F2-AS1 和 miR-129-5p 在膠質瘤中的表達及其對膠質瘤 U251 細胞增殖和凋亡的影響。

qRT-PCR 檢測 lncRNA NR2F2-AS1 和 miR-129-5p 在膠質瘤組織和細胞中表達水平，MTT 法和流式細胞術檢測 U251 細胞增殖和凋亡，Western blot 檢測細胞中CyclinD1、p21、Bax 和 Bcl-2 的蛋白表達水平，雙熒光素酶報告系統驗證 NR2F2-AS1 和 miR-129-5p 的調控關系。

與正常腦組織相比，在膠質瘤組織中 lncRNA NR2F2-AS1 的含量顯著升高（< 0.05），miR-129-5p 的含量則顯著下降（< 0.05）；干擾 NR2F2-AS1 表達和過表達 miR-129-5p 均可抑制膠質瘤 U251 細胞增殖并促進細胞凋亡，使細胞中 CyclinD1 和 Bcl-2 含量降低（< 0.05），p21 和 Bax 含量升高（< 0.05）；lncRNA NR2F2-AS1 靶向負調控 miR-129-5p 的表達；抑制 miR-129-5p 表達逆轉了干擾 NR2F2-AS1 表達對 U251 細胞增殖、凋亡的作用。

干擾 lncRNA NR2F2-AS1 通過靶向促進 miR-129-5p表達抑制膠質瘤 U251 細胞增殖，誘導細胞凋亡。LncRNA NR2F2-AS1 可能是膠質瘤的分子靶點。

膠質瘤； U251 細胞； NR2F2-AS1； miR-129-5p； 增殖； 凋亡

膠質瘤是常見的原發性惡性腦腫瘤，主要治療手段是手術和放化療，但治療效果差，患者生存期短，預后較差[1]。研究抑制膠質瘤的分子機制，尋找潛在的個性化精準治療靶點，已成為膠質瘤基礎研究領域的熱點。

研究表明，長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）可能通過參與信號通路調控機制與microRNA（miRNA）相互作用，影響膠質瘤的生長和進展[2]。研究表明，核受體亞家族 2 組 F 成員 2 反義 RNA1（nuclear receptor subfamily 2 group F member 2-antisense RNA 1，NR2F2-AS1）在前列腺癌[3]、結直腸癌[4]、非小細胞肺癌[5]組織中表達上調，與癌細胞的增殖和凋亡有關，但其在膠質瘤中的作用尚不清楚。本研究通過 LncBase 預測發現，miR-129-5p 可能是NR2F2-AS1 的靶基因。miR-129-5p 在膠質瘤組織和細胞中表達下調，過表達 miR-129-5p 抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡[6]。miR-129-5p 和NR2F2-AS1 在膠質瘤中是否存在某種調控關系，尚不清楚。

本課題以膠質瘤 U251 細胞為主要研究對象，研究 NR2F2-AS1 和 miR-129-5p 對U251 增殖、凋亡的影響及潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

2016 年 6 月– 2017 年 6 月于本院病理檢查確診為膠質瘤的患者 20 例，其中男 12 例，女8 例，年齡 21 ~ 65（43.2 ± 14.8）歲，膠質瘤分級：I 級 2 例，II 級 5 例，III 級 8 例，IV 級 5 例。留取 20 例患者手術切除的膠質瘤組織，同時選擇 20 例志愿者（腦外傷行顱內減壓手術患者）正常腦組織作為對照。所有患者術前未接受放療和化療。本研究通過醫院醫學倫理委員會批準，并與所有患者或其家屬、志愿者簽訂知情同意書。

人膠質母細胞瘤細胞株 U251 購自美國 ATCC；高糖 DMEM 培養基和胎牛血清（FBS）購自美國 Gibco 公司；胰蛋白酶、噻唑藍（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）購自美國 Sigma-Aldrich 公司；Trizol 試劑、Real-time PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒（RT-PCR）和 Lipofectamine 2000 轉染試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；流式細胞儀和流式試劑盒購自美國 BD 公司；NR2F2-AS1 干擾劑（si-NR2F2-AS1）、NR2F2-AS1 過表達載體（pcDNA-NR2F2-AS1）、miR-129-5p 模擬物（miR- 129-5p）、miR-129-5p 抑制劑（anti-miR-129-5p）、陰性對照（si-NC、miR-NC、pcDNA、anti-miR-NC）、NR2F2-AS1 野生型和突變型雙熒光素酶報告載體均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；CyclinD1 抗體、p21 抗體、Bax 抗體、Bcl-2 抗體和 GAPDH 抗體購自美國 Santa Cruze 公司；雙熒光素酶報告系統購自美國 Promega 公司；全自動酶標儀及 Real-time PCR 儀購自美國 Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將 U251 細胞用含10% FBS、1% 青-鏈霉素的高糖 DMEM 培養液培養，然后將培養瓶置于37 ℃ 5% CO2培養箱中，濕度 95%。待細胞生長至對數生長期時，洗滌消化，1:3 傳代。

1.2.2 細胞轉染 收集對數生長期的 U251 細胞，以2 × 105個/孔接種于 6 孔板中，細胞培養至融合為一層時進行轉染。用 Lipofectamine 2000 將si-NC、si-NR2F2-AS1、miR-NC、miR-129-5p、pcDNA、pcDNA-NR2F2-AS1、si-NR2F2-AS1 + anti-miR-NC、si-NR2F2-AS1 + anti-miR-129-5p、WT-NR2F2-AS1 + miR-NC、WT-NR2F2-AS1 + miR-129-5p、MUT-NR2F2-AS1 + miR-NC 和 MUT-NR2F2-AS1 + miR-129-5p 轉染入培養好的 U251 細胞中，培養 4 h，換成完全培養基，轉染48 h，收集細胞。

1.2.3 Real-time PCR 檢測 RNA 的表達 收集膠質瘤組織和正常腦組織樣本及各組轉染后的 U251 細胞，提取組織樣本和細胞總 RNA，然后反轉錄合成 cDNA，然后以 cDNA 為模板進行 Real-time PCR 反應合成 lncRNA NR2F2-AS1 和 miR-129-5p，反應程序為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s、59 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，35 個循環；72 ℃ 10 min。引物如下：miR-129-5p 上游：5' GGGGGCTTTTT GCGGTCTGG 3'，下游：5' AGTGCGTGTCGGAG TC 3'；NR2F2-AS1 上游：5' CTCTGGGAATCGTCC TGTATGC 3'，下游：5' TGGTTTCCTGGTTCTCTG CC 3'。用 2?ΔΔCt方法進行數據分析。

1.2.4 MTT 實驗測定細胞活性 收集轉染后的U251 細胞，以 2 × 103個/孔接種于96 微孔板中，置培養箱繼續培養，分別在 24、48、72 h 時進行 MTT 實驗，每孔加入 5 mg/ml 的 MTT 20 μl，培養 4 h，棄上清，加入 DMSO 150 μl/孔，室溫振蕩 10 min，酶標儀測定 490 nm 吸光度值。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 將培養至對數生長期的各組轉染后的 U251 細胞接種于 6 孔板中，繼續培養 48 h，收集細胞，洗滌 2 次，根據凋亡試劑盒說明書操作，用 400 μl 標記緩沖液重懸細胞，加入 5 μl Annexin V-FITC 和 10 μl 碘化丙啶（PI），室溫避光 20 min，用流式細胞儀檢測凋亡率。

1.2.6 雙熒光素酶報告系統實驗 根據 1.2.2 進行 U251 細胞的培養和轉染，將構建的 lncRNA NR2F2-AS1 的野生型（WT-NR2F2-AS1）和突變型（MUT-NR2F2-AS1）雙熒光素酶報告載體，分別與 miR-NC 或 miR-129-5p 共轉染 U251 細胞，轉染 48 h，收集細胞，裂解細胞，離心收集上清，檢測上清中熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 lncRNA NR2F2-AS1 和 miR-129-5p 在膠質瘤組織中的表達

與正常腦組織相比，在膠質瘤組織中 lncRNA NR2F2-AS1 的含量顯著升高（< 0.05），miR-129-5p 的含量則顯著下降（< 0.05），見表 1。

表 1 lncRNA NR2F2-AS1 和 miR-129-5p在膠質瘤組織中的表達（，n = 20）

注：與正常腦組織組比較，*< 0.05。

Note:*0.05 vs normal brain tissue.

2.2 干擾 lncRNA NR2F2-AS1 表達可抑制膠質瘤 U251 細胞增殖

干擾 NR2F2-AS1 表達后，膠質瘤 U251 細胞中 lncRNA NR2F2-AS1 含量顯著下降（< 0.05），細胞490在 24、48 和 72 h 均顯著下降（< 0.05），CyclinD1 表達降低（< 0.05），p21 表達升高（< 0.05），見圖 1 和表 2。說明干擾 NR2F2-AS1 表達可以抑制膠質瘤 U251 細胞增殖。

2.3 干擾 lncRNA NR2F2-AS1 表達可誘導膠質瘤 U251 細胞凋亡

干擾 lncRNA NR2F2-AS1 表達后，U251 細胞凋亡率顯著增加（< 0.05），細胞中Bax 含量升高（< 0.05），Bcl-2 表達降低（< 0.05），見圖 2 和表 3。說明干擾 NR2F2-AS1 表達可誘導 U251 細胞凋亡。

2.4 miR-129-5p 過表達可抑制膠質瘤 U251 細胞增殖、誘導細胞凋亡

過表達 miR-129-5p 后，U251 細胞中 miR-129-5p 含量顯著升高（< 0.05），細胞490在 48 h 和 72 h 時顯著下降（< 0.05），細胞凋亡率升高（< 0.05），CyclinD1和 Bcl-2 含量降低（< 0.05），p21 和 Bax 含量升高（< 0.05），見圖 3 和表 4。說明過表達 miR-129-5p 可抑制 U251 細胞增殖，促進細胞凋亡。

圖 1 增殖相關蛋白表達

Figure 1 Expression of proteins related to proliferation

表 2 干擾 lncRNA NR2F2-AS1 表達對膠質瘤 U251 細胞增殖的影響（，n = 9）

注：與si-NC 組比較，*< 0.05。

Note:*< 0.05 vs si-NC group.

圖 2 干擾 lncRNA NR2F2-AS1 表達對膠質瘤 U251 細胞凋亡的影響（A：凋亡相關蛋白表達；B：細胞凋亡流式圖）

Figure 2 Effect of interfering the expression of NR2F2-AS1 on apoptosis of glioma U251 (A: Expression of apoptosis-related proteins; B: Flow charts of apoptosis)

表 3 干擾 lncRNA NR2F2-AS1 表達對膠質瘤 U251 細胞凋亡的影響（，n = 9）

注：與 si-NC 組比較，*< 0.05。

Note:*< 0.05vssi-NC group.

圖 3 miR-129-5p 過表達對膠質瘤 U251 細胞增殖和凋亡的影響（A：增殖、凋亡相關蛋白表達；B：細胞凋亡流式圖）

Figure 3 Effects of miR-129-5p over-expression on proliferation and apoptosis of glioma U251 cells (A: Expression of proteins related to proliferation and apoptosis; B: Flow charts of apoptosis)

表 4 過表達 miR-129-5p 對膠質瘤 U251 細胞增殖和凋亡的影響（，n = 9）

注：與 miR-NC 組比較，*< 0.05。

Note:*0.05vsmiR-NC group.

2.5 lncRNA NR2F2-AS1 靶向調控 miR-129-5p 的表達

LncBase 預測結果顯示，lncRNA NR2F2-AS1的序列中含有與 miR-129-5p 互補的序列，見圖 4。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，過表達miR-129-5p 組野生型 WT-NR2F2-AS1 的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降（0.05），而突變型 MUT-NR2F2-AS1 的螢火蟲熒光素酶相對活性無明顯變化，見表 5。qRT-PCR 結果發現，過表達 NR2F2-AS1 可顯著下調 miR-129-5p 含量（< 0.05）；干擾 NR2F2-AS1 表達顯著上調 miR-129-5p 表達量（< 0.05），見表 6。說明 lncRNA NR2F2-AS1 靶向負調控 miR-129-5p 的表達。

圖 4 NR2F2-AS1 的序列中含有與 miR-129-5p 互補的核苷酸序列

Figure 4 NR2F2-AS1 contains nucleotide sequences complementary to miR-129-5p

表 5 雙熒光素酶報告實驗（，n = 9）

注：與 miR-NC 組比較，*< 0.05。

Note:*< 0.05vsmiR-NC group.

表 6 NR2F2-AS1 和 miR-129-5p 在膠質瘤U251 細胞中的調控關系（，n = 9）

注：與 pcDNA 組比較，#0.05；與 si-NC 組比較，&0.05。

Note:#< 0.05vspcDNA group;&< 0.05vssi-NC group.

2.6 抑制 miR-129-5p 表達逆轉了干擾 NR2F2-AS1 表達對膠質瘤 U251 細胞增殖和凋亡的作用

為確認 lncRNA NR2F2-AS1 通過調控 miR-129-5p 發揮對 U251 細胞的增殖和凋亡的影響作用，在干擾 NR2F2-AS1 的同時抑制 miR-129-5p 轉錄。結果表明，干擾NR2F2-AS1 同時抑制 miR-129-5p 轉錄后，U251 細胞中miR-129-5p 水平下降（< 0.05），細胞在 24、48 和 72 h 時細胞490顯著升高（< 0.05），細胞凋亡率降低（< 0.05），CyclinD1 和 Bcl-2 含量升高（< 0.05），p21 和 Bax 含量下降（< 0.05），見圖 5 和表 7。說明抑制 miR-129-5p 表達逆轉了干擾 NR2F2-AS1 表達對 U251 細胞增殖、凋亡的作用。

3 討論

大量研究表明，lncRNA 在惡性膠質瘤組織和細胞系異常表達，可能對膠質瘤的發生、發展等惡性表型具有重要意義[7]。LncRNA NR2F2-AS1 又稱核受體亞家族 2 組 F 成員 2反義 RNA1，其在多種腫瘤組織中表達異常[3-5]，下調其表達可抑制癌細胞的增殖并促進細胞凋亡。NR2F2-AS1 在卵巢癌組織中表達下調，I ~ II 期卵巢癌組織中的表達水平明顯低于 III ~ IV 期，與患者的病理分期有關[8]。LncRNA NR2F2-AS1 在膠質瘤中表達和作用尚不清楚。本研究通過檢測 20 例膠質瘤組織和正常腦組織發現，與正常腦組織相比，在膠質瘤組織中NR2F2-AS1 的表達量顯著升高，干擾 NR2F2-AS1 表達可以抑制膠質瘤 U251 細胞增殖，誘導 U251 細胞凋亡，說明在膠質瘤中 lncRNA NR2F2-AS1 具有重要作用。

圖 5 抑制 miR-129-5p 表達逆轉了干擾 lncRNA NR2F2-AS1 表達對膠質瘤 U251 細胞增殖和凋亡的作用（A：增殖、凋亡相關蛋白表達；B：細胞凋亡流式圖）

Figure 5 Inhibition of miR-129-5p reversed the effects of interfering NR2F2-AS1 on the proliferation and apoptosis in glioma U251 cells (A: Expression of proteins related to proliferation and apoptosis; B: Flow charts of apoptosis)

分組GroupsmiR-129-5pOD490凋亡率（%）Apoptosis rate (%)CyclinD1 蛋白CyclinD1 proteinp21 蛋白p21 proteinBcl-2 蛋白Bcl-2 proteinBax 蛋白Bax protein 24 h48 h72 h si-NC1.01 ± 0.080.36 ± 0.030.68 ± 0.060.97 ± 0.096.87 ± 0.690.66 ± 0.060.30 ± 0.030.72 ± 0.070.21 ± 0.03 si-NR2F2-AS12.51 ± 0.25*0.32 ± 0.03*0.41 ± 0.04*0.57 ± 0.05*20.65 ± 2.14*0.27 ± 0.03*0.76 ± 0.06*0.31 ± 0.03*0.63 ± 0.05* si-NR2F2-AS1 +anti-miR-NC2.54 ± 0.240.31 ± 0.030.38 ± 0.030.54 ± 0.0521.48 ± 2.210.26 ± 0.030.77 ± 0.070.28 ± 0.030.62 ± 0.06 si-NR2F2-AS1 +anti-miR-129-5p1.43 ± 0.14#0.35 ± 0.04#0.61 ± 0.05#0.84 ± 0.07#12.79 ± 1.34#0.54 ± 0.05#0.42 ± 0.04#0.61 ± 0.06#0.33 ± 0.03# F147.1604.74491.25587.600147.341181.481186.845167.068202.443 P 0.0000.007 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

注：與 si-NC 組比較，*0.05；與 si-NR2F2-AS1 + anti-miR-NC 組比較，#0.05。

Note:*0.05vssi-NC group;#0.05vssi-NR2F2-AS1 + anti-miR-NC group.

本研究通過 LncBase 預測發現，NR2F2-AS1 的序列中含有與 miR-129-5p 互補的核苷酸序列，預示 NR2F2-AS1 與 miR-129-5p 之間可能存在結合位點或調控關系。miR-129-5p是 miR-129 的主要功能型成熟產物，參與調控多種腫瘤的增殖、凋亡、侵襲遷移等生物學過程，并在炎癥反應、血管再生和神經發育等過程中起調控作用[9]。miR-129-5p 在非小細胞肺癌[10]、前列腺癌[11]、胰腺癌[12]、胃癌[13]、乳腺癌[14]等腫瘤組織和細胞中低表達，過表達 miR-129-5p 可抑制腫瘤增殖、遷移、侵襲和促進細胞凋亡。miR-129-5p 在多形性膠質母細胞瘤（GBM）中表達下調，通過靶向 Wnt5a 阻斷 PKC/ERK/NF-κB 和 JNK 通路抑制 GBM 細胞增殖、侵襲、遷移、血管生成、神經球形成和阻斷對替莫唑胺的抵抗[15]。miR-129-5p 在膠質瘤中低表達，與膠質瘤分級呈負相關，過表達 miR-129-5p 可靶向 DNMT3A 抑制細胞的增殖，阻滯 G1 期細胞周期[16]；miR-129-5p 還可靶向 FNDC3B 抑制 GBM 細胞活性、增殖、遷移和侵襲等細胞過程[17]。本研究結果表明，與正常腦組織相比，miR-129-5p 在膠質瘤組織中水平下降，過表達 miR-129-5p 可抑制膠質瘤 U251 細胞增殖，促進細胞凋亡，與前述研究結論[15-17]一致。

雙熒光素酶報告系統和 qRT-PCR 結果表明，lncRNA NR2F2-AS1 靶向負調控miR-129-5p 的表達，進一步研究發現，抑制 miR-129-5p 表達逆轉了干擾 NR2F2-AS1 表達對 U251 細胞增殖、凋亡的作用，說明兩者在膠質瘤細胞中具有調控關系。

綜上，本研究闡述了在膠質瘤組織中，lncRNA NR2F2-AS1 上調，miR-129-5p 下調；lncRNA NR2F2-AS1 在膠質瘤 U251 細胞中靶向 miR-129-5p 調控 U251 細胞增殖和凋亡，lncRNA NR2F2-AS1 和 miR-129-5p 是膠質瘤的潛在分子靶點，對膠質瘤的基礎和臨床研究具有重要意義。

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LncRNA NR2F2-AS1 regulates proliferation and apoptosis of the glioma cells by targeting miR-129-5p

ZHANG Da-peng, YANG Yan-hui

Department of Neurosurgery, Xinxiang Central Hospital, Henan 453000, China (ZHANG Da-peng); Department of Ultrasound, Huixian People′s Hospital, Henan 453600, China (YANG Yan-hui)

To investigate the expression of lncRNA NR2F2-AS1 and miR-129-5p in gliomas and their effects on the proliferation and apoptosis of U251 cells.

Expression levels of lncRNA NR2F2-AS1 and miR-129-5p were measured by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The proliferation and apoptosis of U251 cells were determined by MTT assay and flow cytometry, respectively. Expression of CyclinD1, p21, Bax and Bcl-2 were detected by Western blot. Dual-luciferase reporting assay system was performed to confirm the targeted relationship between lncRNA NR2F2-AS1 and miR-129-5p.

Compared with normal brain tissue, the level of lncRNA NR2F2-AS1 in glioma tissues was increased significantly (< 0.05), and the level of miR-129-5p was decreased remarkably (< 0.05). Interfering with the expression of NR2F2-AS1 and over-expression of miR-129-5p inhibited the proliferation and promoted the apoptosis of glioma U251 cells, and reduced the expression levels of CyclinD1 and Bcl-2 in the cells (< 0.05), while increased the content of p21 and Bax (< 0.05). LncRNA NR2F2-AS1 targets and negatively regulates the expression of miR-129-5p. Inhibition of miR-129-5p reversed the effects of interfering NR2F2-AS1 on the proliferation and apoptosis of U251 cells.

Interfering lncRNA NR2F2-AS1 inhibits the proliferation and induces apoptosis of glioma U251 cells by targeting and promoting the expression of miR-129-5p. LncRNA NR2F2-AS1 may be a molecular target of glioma.

Glioma; U251 cells; NR2F2-AS1; miR-129-5p; Proliferation; Apoptosis

·協會之窗·

兩家會員單位通過牛血清生產質量達標自律檢查

經過材料審核，牛血清產品質量控制檢查組的現場檢查與中國食品藥品檢定研究院三批次樣品抽檢，協會兩家會員單位通過牛血清生產質量達標自律檢查。

通過單位公示如下：

1．蘭州民海生物工程有限公司

證書編號：2019N001

證書有效期：2019 年 10 月– 2024 年 9 月

2．內蒙古維克生生物技術股份有限公司

證書編號：2020N001

證書有效期：2020 年 1 月– 2024 年 12 月

ZHANG Da-peng, Email: zhangyanjiao695@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.03.009

張大鵬，Email：zdp1204@126.com

2019-10-22