新型熒光探針組合用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞中鑒定的研究

于華杰，李浩，李勝

·論著·

新型熒光探針組合用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞中鑒定的研究

于華杰，李浩，李勝

250220 濟(jì)南，濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/山東省腫瘤醫(yī)院肝膽外科（于華杰）；250062 濟(jì)南，山東省藥物研究院（李浩、李勝）

驗(yàn)證新型熒光探針組合鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）的可行性，建立一種新的鑒定 CTCs 的方法。

選取 Eca-109 和 HeLa 兩種腫瘤細(xì)胞系，將腫瘤細(xì)胞系制作成單細(xì)胞懸液代替 CTCs，對(duì)其進(jìn)行分離、熒光探針組合染色和瑞氏吉姆薩染色，分別觀察染色的腫瘤細(xì)胞的形態(tài)，對(duì)比測量到的腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，包括細(xì)胞長徑、細(xì)胞核長徑、細(xì)胞表面積和核質(zhì)比，計(jì)算新型熒光探針組合與瑞氏吉姆薩分別染色腫瘤細(xì)胞系的符合率。在此基礎(chǔ)上，課題組選取5例次腫瘤患者，按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行臨床驗(yàn)證，觀察新型熒光探針組合染色 CTCs 的情況。

分析瑞氏吉姆薩染色和熒光探針組合染色 Eca-109 和 HeLa 的細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞長徑、細(xì)胞核長徑、細(xì)胞表面積和核質(zhì)比均無差異；對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果的均數(shù)分析發(fā)現(xiàn)也無差異。因此，課題組認(rèn)為瑞氏吉姆薩染色和熒光探針組合染色的同一腫瘤細(xì)胞系在形態(tài)學(xué)上是一致的。在 5 例次臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，新型熒光探針組合染色檢出 2 例次。

建立的新型熒光探針組合可用于 CTCs 的檢測。

熒光探針； 循環(huán)腫瘤細(xì)胞； 鑒定； ISET； 瑞氏吉姆薩染色

隨著發(fā)病率和死亡率的增加，癌癥已經(jīng)成為我國最主要死亡原因之一[1]。其中超過 90%的癌癥患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移[2]。1889 年英國病理學(xué)家 Paget[3]指出循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）作為“種子”在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程中起了重要的作用。循環(huán)腫瘤細(xì)胞是指自發(fā)或因診療操作自腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移病灶脫落進(jìn)入外周血循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞[4]。CTCs 的檢測是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及細(xì)胞分離、富集和鑒定，檢測 CTCs 的關(guān)鍵在于如何提高 CTCs 的截留率和如何對(duì)截留的細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別鑒定[5-6]。鑒定 CTCs 的方法按照其應(yīng)用的原理不同，可歸納為 4 類，即：形態(tài)學(xué)鑒定方法、免疫學(xué)鑒定方法、遺傳學(xué)鑒定方法和細(xì)胞生物化學(xué)鑒定方法[7-12]，目前尚無明確的鑒定 CTCs的“金標(biāo)準(zhǔn)”。CTCs 是癌細(xì)胞的一種特殊存在方式[13]，課題組認(rèn)為解決 CTCs 鑒定的方法可以借鑒傳統(tǒng)病理學(xué)對(duì)癌細(xì)胞的鑒定。目前活檢是傳統(tǒng)病理學(xué)臨床疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[14]。活檢區(qū)分癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞的方法可以歸納為三個(gè)方面：病理形態(tài)學(xué)改變、生物學(xué)行為改變和相關(guān)技術(shù)檢測結(jié)果[15]。結(jié)合傳統(tǒng)病理學(xué)診斷技術(shù)、ISET 技術(shù)和免疫學(xué)方法，本課題組提出了物理方法捕獲-形態(tài)方法識(shí)別-免疫方法鑒定的檢測思路[16]。依據(jù)上述思路，前期課題組建立并驗(yàn)證了“ISET-ICC技術(shù)”[17]。“ISET-ICC技術(shù)”先通過物理方法捕獲 CTCs，再以形態(tài)學(xué)方法識(shí)別 CTCs，最后利用 ICC 法排除血液來源細(xì)胞的方法鑒定 CTCs[16-18]。這種“陰性排除”的方法，對(duì)形態(tài)學(xué)疑似 CTCs 的非血液來源細(xì)胞無法識(shí)別，課題組需要探索一種新的“直接”鑒定 CTCs 的方法。

熒光探針是一種與靶標(biāo)結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光光譜變化的探針，并且這種變化能用來檢測細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)。在應(yīng)用探針時(shí)首先是在一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中確定一個(gè)明確靶標(biāo)，這種靶標(biāo)可以是分子、離子、細(xì)胞器或其他實(shí)體，熒光探針與之結(jié)合使目標(biāo)可以被檢測并且可用光度法和顯微鏡直接定量[19]。新型熒光探針組合是利用多種熒光探針復(fù)合染色的方法，可分別標(biāo)記細(xì)胞膜、細(xì)胞核、核仁、線粒體、細(xì)胞器等。課題組希望利用新型熒光探針（DiI、Hoechst 33342 和PY 組合）染色 CTCs 的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，達(dá)到“直接”鑒定 CTCs 的目的。

課題組選取食管癌 Eca-109 和宮頸癌 HeLa 這兩種腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行新型熒光探針（DiI、Hoechst 33342 和 PY 組合）用于 CTCs 鑒定的實(shí)驗(yàn)，初步確定了新型熒光探針組合（DiI、Hoechst 33342 和PY 組合）鑒定 CTCs 的 SOP。課題組選取符合入組標(biāo)準(zhǔn)的 5 例惡性腫瘤患者，驗(yàn)證了新型熒光探針組合染色患者外周血的 CTCs 的可行性和鑒定標(biāo)準(zhǔn)并優(yōu)化了 SOP。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 HeLa 細(xì)胞系山東大學(xué)功能晶體材料實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)與（中國科學(xué)院細(xì)胞庫編號(hào)：TCHu 187）；Eca-109 細(xì)胞系是山東省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)與（中國科學(xué)院細(xì)胞庫編號(hào)：TCHu 69），用37 ℃的胰蛋白酶分解為穩(wěn)定的單細(xì)胞懸液。

1.1.2 研究對(duì)象 選取 2017 年 6 月– 2017 年 8 月期間在山東省腫瘤防治研究院接受治療且符合入組標(biāo)準(zhǔn)的 5 例惡性腫瘤患者，其中食管癌4 例，肝癌 1 例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①患者有明確的臨床或病理診斷；②年齡≥ 18 歲；③患者及家屬同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有第二原發(fā)的惡性腫瘤；②患有皮膚病病史；③患有嚴(yán)重的血管病變，如脈管炎等。本試驗(yàn)已通過山東省腫瘤防治研究院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)，符合條件的受試者入組前均簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 新型熒光探針組合染色 按照 1:1.5:1.5 的比例配制 Hoechst 33342、PY 和 DiI 工作液。用Hoechst 33342、PY 和 DiI 的工作液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，在蓋玻片的一角加入 100 μl 的染料工作液，輕輕晃動(dòng)使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞，然后在室溫下放置 30 min。放置到熒光顯微鏡下選擇三個(gè)通道，第一個(gè)通道采集Hoechst 33342 的光，選用 405 nm 作為激發(fā)光，收集 420 ~ 470 nm 的熒光；第二個(gè)通道采集 PY 的光，選用 405 nm 作為激發(fā)光，收集 500 ~ 560 nm 的熒光；第三個(gè)通道采集 DiI的光，選用 543 nm 作為激發(fā)光，收集 560 ~ 600 nm 的熒光。本次研究在熒光染色實(shí)驗(yàn)中 CTCs 的判定標(biāo)準(zhǔn)如下：①細(xì)胞核大小變異大（比率 > 0.5）；②細(xì)胞核大于 24 μm；③細(xì)胞核形狀不規(guī)則；④核仁較多（> 3 個(gè)）或大核仁；⑤高核質(zhì)比。只要同時(shí)符合以上至少 4 個(gè)特征，就可從形態(tài)學(xué)上認(rèn)為是循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

1.2.2 瑞氏吉姆薩染色 新型熒光探針組合染色后的玻片，使用移液器加入適量 Diff-A 染液，染色 1 min，然后加入 100 μl PBS 將 Diff-A 染液稀釋，棄掉稀釋的染液。加入 300 μl Diff-B 染液，染色 2 min，棄掉 Diff-B 染液。沖洗后，放入50 ℃干燥箱中。甘油封片，顯微鏡下判讀并拍照。循環(huán)腫瘤細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)：①細(xì)胞核大小變異大（比率 > 0.5）；②細(xì)胞核大于 24 μm；③細(xì)胞核形狀不規(guī)則；④染色質(zhì)染色存在三維層次；⑤高核質(zhì)比。只要同時(shí)符合以上至少 4 個(gè)特征，就可從形態(tài)學(xué)上認(rèn)為是循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

1.2.3 CD45 免疫化學(xué)染色 將瑞氏吉姆薩染色的玻片放入 DI 水中，潤洗 5 min，將載玻片依次放入梯度無水酒精脫色，滴加 100 μl 0.1% Triton X-100，室溫孵育 15 min，滴加 100 μl 0.3% H2O2，室溫孵育 10 min，滴加 100 μl CD45 一抗，室溫孵育 1 h，滴加 100 μl 山羊抗兔/小鼠 IgG/HRP，室溫孵育 15 min 滴加 100 μl DAB 顯色液，室溫孵育并隨時(shí)在顯微鏡下觀察顯色情況，顯色完成后，棄掉 DAB 顯色液，蘇木素染色 5 min。鹽酸酒精分化 8 s，DI 水返藍(lán) 5 min，梯度酒精脫水，晾干，中性樹脂封固，顯微鏡下觀察。CD45 染色后陽性細(xì)胞判讀標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核染色為藍(lán)色（蘇木素），細(xì)胞膜染色為棕黃色（DAB），陰性細(xì)胞判讀標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核染色為藍(lán)色（蘇木素），核周圍無棕黃色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用 SPSS v2.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用配對(duì)檢驗(yàn)比較兩種染色方法的細(xì)胞長徑、核長徑、細(xì)胞表面積和核質(zhì)比。對(duì)三組配對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。< 0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新型熒光探針組合 SOP 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取 2 種腫瘤細(xì)胞系（Eca-109 和 HeLa）進(jìn)行新型熒光探針組合染色實(shí)驗(yàn)的研究。課題組將細(xì)胞系制成穩(wěn)定的單細(xì)胞懸液；利用 ISET 法對(duì)單細(xì)胞懸液進(jìn)行分離；分離后的細(xì)胞進(jìn)行熒光探針組合染色，觀察并對(duì)細(xì)胞染色情況進(jìn)行拍照（圖 1）。熒光探針組合染色清晰呈現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)分界清晰，可進(jìn)行測量，更加精確地從形態(tài)學(xué)特征上判定細(xì)胞是否為 CTCs；對(duì)已熒光探針組合染色的細(xì)胞進(jìn)行瑞氏吉姆薩染色，觀察并對(duì)細(xì)胞染色情況進(jìn)行拍照（圖 2）。

圖 1 Eca-109 進(jìn)行新型熒光探針組合染色（× 40）（A：組合圖；B：細(xì)胞膜；C：細(xì)胞質(zhì)；D：細(xì)胞核）

Figure 1 Eca-109 combined fluorescent probe staining (× 40) (A: Combination diagram; B: Cell membrane; C: Cytoplasm;D: Nucleus)

圖 2 Eca-109 瑞氏吉姆薩染色（× 100）

Figure 2 Wright's Giemsa staining of Eca-109 (× 100)

2.2 兩種染色方法腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的比較

課題組采用 Image J 測量軟件，對(duì)比了熒光探針組合染色和瑞氏吉姆薩染色檢測的 Eca-109 細(xì)胞系（表 1）和 HeLa 細(xì)胞系（表 2）的細(xì)胞長徑、核長徑、細(xì)胞表面積和核質(zhì)比的平均值，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)瑞氏吉姆薩染色和熒光探針組合染色2 種腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果的均數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞長徑、細(xì)胞核長徑、細(xì)胞表面積和核質(zhì)比均無差異（表 3）。因此課題組認(rèn)為瑞氏吉姆薩染色和熒光探針組合染色的同一腫瘤細(xì)胞系在形態(tài)學(xué)上是一致的。

2.3 新型熒光探針組合 SOP 的臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

課題組分別對(duì) 5 例腫瘤患者的外周血進(jìn)行了分離，利用熒光探針組合染色、瑞氏吉姆薩染色和 CD45 免疫化學(xué)染色檢測其中 CTCs，其中熒光探針組合染色檢出 2 例（YG04 和 YG05），瑞氏吉姆薩染色檢出 0 例，CD45 免疫化學(xué)染色檢出0 例（圖 3，表 4）。通過 5 例驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，課題組認(rèn)為新型熒光探針組合染色可用于鑒定腫瘤患者外周血 CTCs。

表 2 宮頸癌細(xì)胞系 HeLa 的細(xì)胞形態(tài)學(xué)測量結(jié)果的比較

表 3 2 種細(xì)胞系細(xì)胞形態(tài)學(xué)測量結(jié)果均數(shù)的比較

Figure 3 Combined fluorescent probe staining of CTCs (YG04 Li×cheng) (A: Combination diagram; B: Cell membrane; C: Cytoplasm; D: Nucleus) (× 40)

3 討論

課題組對(duì)兩種細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)熒光探針組合染色能夠染色腫瘤細(xì)胞，在顯微鏡下能夠清晰分辨各細(xì)胞結(jié)構(gòu)，邊界清晰。對(duì)已熒光染色的細(xì)胞進(jìn)行瑞氏吉姆薩染色，在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞結(jié)構(gòu)的邊界較為模糊。瑞氏吉姆薩染色是目前細(xì)胞學(xué)中重要的染色方法之一[14]，是通過酸性染料和堿性染料對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的親和力來著色細(xì)胞。新型熒光探針組合是通過不同探針分別染色細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，所以能更清晰觀察精確地測量各細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可明確判定 CTCs。

對(duì)兩種方法染色的腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征（包括細(xì)胞長徑、細(xì)胞核長徑、細(xì)胞表面積和核質(zhì)比）進(jìn)行了測量和比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；又對(duì)兩種細(xì)胞系細(xì)胞形態(tài)學(xué)測量結(jié)果均數(shù)進(jìn)行比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明兩種染色方法對(duì)細(xì)胞形態(tài)無影響，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果上是符合的。課題組在腫瘤細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取了 5 例次惡性腫瘤患者進(jìn)行了臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。新型熒光探針組合檢出 2 例次，4 個(gè) CTCs；瑞氏吉姆薩染色未檢出。熒光探針組合染色的 CTCs 細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均清晰可辯，符合制訂的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。通過腫瘤細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩種染色之間互無影響，分析瑞氏吉姆薩染色未檢出的原因可能有2 個(gè)，其一，瑞氏吉姆薩染色未能著色或著色較差無法判定；其二，熒光探針組合染色無沖洗玻片步驟，瑞氏吉姆薩染色需沖洗玻片，可能造成了細(xì)胞脫落和移位。通過觀察新型熒光探針組合染色 CTCs 的情況，驗(yàn)證了染色 CTCs 可行性。下一步課題組將通過 27 例惡性腫瘤患者的臨床試驗(yàn)研究進(jìn)一步確定新型熒光探針組合用于 CTCs 鑒定的操作手冊和鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

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A novel combined fluorescent probe staining method for CTCs identification

YU Hua-jie, LI Hao, LI Sheng

School of Medicine and Life Sciences, Jinan University, Jinan 250220, China (YU Hua-jie); Shandong Institute of Materia Medica, Jinan 250062, China (LI Hao, LI Sheng)

To verify the feasibility of a novel combination of fluorescent probes to identify circulating tumor cells (CTCs), and to establish a new method for identifying CTCs.

Two types of tumor cell lines (Eca-109 and HeLa) were selected by the research group. The tumor cell lines were made into single-cell suspensions instead of CTCs. The new fluorescent probe combination SOP was developed and compared. Morphological characteristics of tumor cells, including cell diameter, nucleus diameter, cell surface area, and nuclear-to-cytoplasmic ratio, were measured by fluorescent probe and Wright's Gemsa staining. The coincidence rate of the new fluorescent probe combination with Wright'sGimsa staining tumor cell lines was calculated with preliminary determination of the new fluorescent probe combination to identify the SOPs of CTCs.On this basis, 5 tumor patients were selected according to the above experimental methods and CTCs were observed by the combination of new fluorescent probes staining.

The morphological results of two tumor cell lines (Eca-109 and HeLa) stained by Wright's Giemsa staining and fluorescent probes were analyzed. It was found that the cell diameter, nucleus diameter, cell surface area, and nuclear-to-cytoplasm ratio were all no difference. Therefore, after morphological analysis, there was no difference in the cell morphological results of the two tumor cell lines (Eca-109 and HeLa) stained by Wright's Giemsa staining and fluorescent probe combination. The mean of cell morphology results of the two tumor cell lines stained by Wright's Giemsa staining and fluorescent probes was analyzed, and no difference was found in cell diameter, nucleus diameter, cell area, and cytoplasmic ratio. Therefore, after morphological analysis, the same tumor cell line stained by Wright's Giemsa staining and fluorescent probe combination was morphologically consistent.In 5 clinical verification experiments, 2 cases were detected by combined staining of new fluorescent probes. Therefore, the SOP for identification of CTCs by combined staining of new fluorescent probes was feasible.

The new fluorescent probe combination can be used for the detection of CTCs, and the research team has established a new method for identifying CTCs.

Fluorescence probe; Circulating tumor cell; Identification; ISET; Wright's Giemsa staining

LI Sheng, Email: drlisheng@sohu.com

山東省重大科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2017CXGC1204）

李勝，Email：drlisheng@sohu.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.03.010

2020-02-24