基于網絡藥理學和分子對接法篩選藏藥五味沙棘散治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）活性成分的研究＊

劉 川，蘇錦松，李軒豪，唐 策，劉 悅，張 藝

（1.成都中醫藥大學 民族醫藥學術傳承創新研究中心 成都 611137；2.成都中醫藥大學 民族醫藥學院 成都 611137；3.成都中醫藥大學 中醫藥創新研究院 成都 611137；4.成都大學 四川抗菌素工業研究所 成都 610037）

2019年12月以來，一種新型冠狀病毒（SARSCoV-2）引起的COVID-19侵襲我國，成為人類嚴重呼吸道感染的原因[1]，截至2020年3月19日，我國確診病例約80967例，累計死亡病例近3132例[2]。此外，感染疫情仍在迅速蔓延，并波及全球20多個國家和地區，這對全球健康、公共衛生安全構成了巨大威脅[3]。目前還未發現治療該病毒的特效藥物，發現新的防治藥物迫在眉睫。

藏醫學是祖國傳統醫學的重要組成部分，在防治疫病領域積累了豐富的經驗，藏醫認為新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）可納入藏醫“年仍奈（即疫病）范疇，屬熱性病，表現出發病迅速而猛烈、病勢危急、傳染性極強、普遍流行等特點[4]。“年仍奈”在發病早期，會呈現初期熱性癥狀，體外時令、邪氣變化，使體內三因（隆、赤巴、培根）失調，出現與溫熱病邪激烈相爭的過程，可通過遠離邪氣，熱之寒者，最終調和三因平衡而使熱病趨向治愈[5]。《藏醫臨床札記》記載[6]：復方五味沙棘散（藏文名：????????????）由沙棘、余甘子、木香、葡萄、甘草配伍組成，具清熱祛痰，潤肺排膿，止咳定喘之效，善于防治因肺熱（血或赤巴偏盛導致培根濕熱偏盛）引起的多種肺部疾病[7]。研究表明，五味沙棘散在臨床上對肺病有良好的治療效果[8]，具有抗感染和免疫調節作用[9]，能有效達到止咳祛痰平喘的效果[10]。

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）屬β屬的新型冠狀病毒，通過冠狀病毒的刺突蛋白（Spike Protein）和人血管緊張素轉換酶Ⅱ（ACE2）受體相互作用附著于宿主細胞，導致病毒入侵機體而致病[11]，細胞絲氨酸蛋白酶（TMPRSS2）能夠激活SARS-CoV-2入侵細胞[12]。上?？萍即髮W饒子和/楊海濤課題[13]組報道了冠狀病毒COVID-19的主蛋白酶3CL水解酶（Mpro，PDB：6LU7），其主要作用是水解病毒復制過程中的兩個多聚蛋白pp1a和pp1ab，抑制病毒的主蛋白酶對于阻止病毒復制可能具有重要作用。

網絡藥理學利用生物分子網絡分析方法，在中藥/民族藥的活性成分的篩選、藥效機理分析、新藥設計和靶點分析中，與藏藥方劑整體性及系統性作用特點高度一致。分子對接技術是研究分子間（如配體和受體）相互作用，并預測其結合模式和親合力的一種理論模擬方法。網絡藥理學與分子對接技術的單一或結合應用，在探索中藥/民族藥效物質基礎、藥物作用機制及闡釋配伍規律的相關研究中被廣泛應用[14-17]。

因此，本文從藏醫藥理論出發，整合網絡藥理學和分子對接技術對藏藥五味沙棘散治療（COVID-19）活性成分進行篩選，為后期抗新型冠狀病毒深入研究及新藥開發提供參考。

1 材料

中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；Pubchem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Swiss Target Prediction數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）；String數據庫（https://string-db.org/）；DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape3.7.2軟件（http://www.cytoscape.org/）；Maestro version 11.5軟件（https://www.schrodinger.com/Maestro/）。

2 方法

2.1 五味沙棘散活性成分篩選

通過TCMSP數據庫和文獻查詢對藏藥五味沙棘散（沙棘、余甘子、木香、甘草、葡萄）的化學成分進行搜集，構建五味沙棘散化學成分數據集。口服利用度（Oral availability，OB）、藥物相似性（Drug likeness，DL）和“類藥五原則”在藥物篩選過程中的為重要參數。設定滿足“OB＞30%”和“DL＞0.18”的成分作為潛在的活性成分，構建五味沙棘散潛在活性成分數據集。

2.2 五味沙棘散活性成分靶點預測

PubChem數據庫是一種包含有機小分子生物活性數據的化學模組數據庫，是NCBI數據庫的子數據庫。Swiss Target Prediction數據庫是用于生物活性小分子靶點蛋白的預測。結合PubChem和Swiss Target Prediction數據庫，獲取五味沙棘散活性成分潛在的作用靶點信息，同時利用String數據庫對靶點進行分析，獲取蛋白相互作用關系，篩選出核心靶點。

2.3 靶點GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

獲得的五味沙棘散活性成分潛在作用靶點導入DAVID 6.8功能注釋（Functional Annotation）工具，選擇Gene Ontology（以下簡稱GO）下的分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）和細胞組成（cellular component，CC）3個部分進行GO功能富集分析，選擇KEGGPathway，進一步尋找活性成分作用靶點顯著富集的主要功能注釋與體內通路，最后利用Cytoscape3.7.2軟件對富集結果進行可視化。

2.4 藥物-化合物-靶點網絡構建與分析

以化合物、篩選獲得的活性成分和預測得到的靶點為目標，利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制靶點相互作用網絡圖和“藥物-化合物-靶點”網絡圖。

2.5 分子對接驗證

采用Maestro version 11.5軟件，將活性成分作為配體與受體血管緊張素轉換酶IIACE2（PDB：1R4L）、細胞絲氨酸蛋白酶TMPRSS2（PDB：6N4T）和COVID-19 3CLpro水解酶（PDB：6LU7）進行分子對接驗證，并對其Docking Score進行分析，用以評價活性成分與靶點之間的結合活性。Docking Score值是評價靶點和化合物結合能力大小的參數，Docking Score的計算負絕對值越大，表明配體與受體的對接親和力就越大，值大于5.0表明有較好的結合活性，大于7.0則說明具有極好的結合活性。

表1 五味沙棘散中潛在活性成分

3 結果

3.1 五味沙棘散活性成分的篩選

分別將沙棘、余甘子、木香、甘草、葡萄干作為關鍵詞，輸入TCMSP數據庫進行檢索并結合文獻對比，通過篩選原則“OB＞30%”、“DL＞0.18”和“類藥五原則”篩選獲得29個潛在活性成分，分別編號為：N1-N29。其中，13個來自甘草、10個來自沙棘、8個來自余甘子、4個來自木香、3個來自葡萄。主要包括黃酮類化合物、酚類化合物和萜類化合物等（見表1、圖1）。

3.2 五味沙棘散活性化合物的靶點預測

通過Swiss Target Prediction數據庫對活性成分進行檢索，共獲得346個潛在作用靶點，合并重復后共獲得147個潛在作用靶點信息。其中，甘草對應100個、沙棘對應79個來自、余甘子對應78個、木香對應19個、葡萄對應7個。進一步通過String數據庫對147個潛在作用靶點進行分析，獲取蛋白相互作用關系，得到的關系文件導入Cytoscape 3.7.2，篩選Degree≥2倍中位數的靶點作為核心靶點，得到32個核心靶點。將獲得32個核心靶點信息，再次通過String數據庫，分析其相互作用關系，利用Cytoscape 3.7.2對分析結果進行可視化展示（圖2）

圖1 五味沙棘散中29個潛在活性化合物的分子式。

3.3 靶點GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

通過將32個核心靶點導入DAVID數據庫進行GO生物學功能注釋和KEGG Pathway分析，得到GO功能富集條目225條（p＜0.05），其中生物過程（BP）條目158條，細胞組成（CC）條目20條，分子功能（MF）條目47條，部分條目（靶點數≥10）見圖3。KEGG通路富集篩選得到35條信號通路（p＜0.05），部分條目（靶點數≥7）見圖4。

3.4 藥物-活性成分-靶點網絡構建與分析

圖2 靶點蛋白相互作用網絡。節點的大小與節點的度值呈正比例關系；綠色到紅色代表度值由小到大

圖3 五味沙棘散靶標的GO富集分析。A：細胞組成；B：分子功能；C：生物過程

藥物-活性成分-靶點網絡共68個節點（5個藥物節點、29個活性成分節點、32個靶點節點）和280條邊（見圖5）。根據網絡的拓撲學性質篩選中心度值（Betweenness Centrality）、親 中 心 度 值（Closeness Centrality）、等級值（degree）較大的節點進行分析，在整個網絡中，相應節點連接數值越大，起到樞紐的作用越強，可能是篩選的核心化合物或者靶點。

圖4 KEGGPathway富集分析氣泡圖

圖5 藥物-活性成分-作用靶點網絡圖。紅色菱形代表藥物，綠色圓形代表活性成分，藍色矩形代表靶點

圖6 成分與關鍵靶點對接得分熱圖

“藥物-活性成分-作用靶點”網絡圖設置degree大于中位數為核心成分，篩選到12個活性成分，分別為：槲皮素、山奈酚、木犀草素、花葵素、24-epicampesterol、麥角甾醇、鞣花酸、α-香樹脂醇、甘草素、甘草苷、甘草異黃烷酮、甘草利酮。

3.5 分子對接驗證

為明確靶點蛋白與所對應的成分之間的結合活性，本研究選取12個核心活性成分為作為配體，以ACE2（PDB：1R4L）、TMPRSS2（PDB：6N4T）和COVID-19 3CLpro水解酶（PDB：6LU7）作為受體，進行分子對接驗證，結果以熱圖形式展示（見圖6）。結果表明，12個活性成分中，花葵素未能成功結合，其余11個活性成分與受體具有較好的結合能力。11個活性成分與ACE2對接打分大于7.0的活性成分2個，介于4.25-7.0之間的活性成分9個，小于4.25的活性成分0個；與TMPRSS2對接打分大于7.0的活性成分0個，介于4.25-7.0之間的活性成分7個，小于4.25的活性成分4個；與COVID-19 3CLpro水解酶對接打分大于7.0的活性成分0個，介于4.25-7.0之間的活性成分10個，小于4.25的活性成分1個。綜合評價12個活性成分與兩個受體結合能力，甘草異黃烷酮、甘草苷、槲皮素、山奈酚等4個成分與受體結合能力最強，提示其可能是五味沙棘散治療新型冠狀病毒肺炎的潛在活性成分。進一步分析了4個潛在活性成分與配體相互作用模式，受體與配體主要以氫鍵和π-π鍵形式結合，結合口袋完全處于受體肽連以內，保證了配體與其的對接結構完整性和穩定性（見圖7）。

4 討論

圖7 甘草異黃烷酮、甘草苷、槲皮素和山奈酚分別與ACE2（PDB：1R4L）、TMPRSS2（PDB：6N4T）和3CLpro（PDB：6LU7）相互作用的分子對接圖

本文整合網絡藥理學和分子對接技術篩選了藏藥五味沙棘散治療新型冠狀病毒肺炎潛在活性成分。通過獲取成分、靶標預測、蛋白互作分析、GO注釋、KEGG通路富集分析和分子對接驗證，最終獲得32個核心靶點、4個核心成分。

通過String數據庫進行蛋白互作分析，得到對32個核心靶點，排名靠前的靶點AKT1、VEGFA、SRC、EGFR、TNF、ESR1、mTOR、IL2等與炎癥和免疫相關。COVID-19感染導致強烈的免疫反應和炎癥風暴，此過程中大量細胞因子被激活[18]。實驗證明，可通過調節IL-6、IL-1和TNF-α等炎性細胞因子而發揮明顯的抗炎作用，糾正機體的“過度免疫”，從而保護肺臟功能和組織結構，以減輕肺損傷[19]，從SARS和MERS的研究發現，免疫反應策略是COVID-19潛在藥物發現的一個重要方向[20]。同時，對這些靶標的功能富集分析發現，它們富集在MAPK signaling pathway、JAKSTAT signaling pathway、TNF signaling pathway、PI3K/Akt signaling pathway免疫和炎癥相關通路，癌癥相關通路，體內代謝信號轉導等生物學過程的一系列信號通路上。以上通路在肺炎治療有著重要作用，Dai等[21]表明可通過TLR4、MAPK和NF-κB等途徑抑制甲型流感病毒復制和流感病毒性肺炎；LEE等[22]表明在264.7巨噬細胞中通過NF-κB、JAK-STAT通路抑制LPS誘導的促炎癥介質的表達。Wu等[23]對COVID-19血漿/血清蛋白磁共振結果分析，富集到Cytokine-cytokine receptor interaction、VEGF signaling, JAK-STAT signaling Pathway等信號通路。吳昊等[24]通過網絡藥理學探討清肺排毒湯治療新型冠狀病毒肺炎機制，表明免疫相關通路T細胞、B細胞通路，以及細胞因子作用相關通路如MAPK信號通路、VEGF信號通路，起到抑制細胞因子、免疫反應、消除炎癥的作用。

通過分子對接，篩選出來綜合評分最高的4個黃酮類活性成分。其中甘草苷、甘草異黃烷酮來自甘草，槲皮素、山柰酚來自沙棘、余甘子和甘草，并且為主要藥效成分。在藏醫藥理論指導下，按照藥味、性效、化味、功能主治配伍原則，以整體觀來闡述藥效物質基礎，體現了藏藥五味沙棘散“多成分-多靶點-多途徑”的作用特點。方中沙棘為君藥，具有清肺、止咳化痰、活血化瘀、治培根等功效；余甘子清熱涼血，甘草、葡萄清熱潤肺、止咳化痰，可助沙棘發揮藥效；佐藥木香健脾和胃。諸藥配伍，共奏清熱、潤肺、排膿、化痰、止咳、平喘之功，達到治療肺炎的作用。該類化合物具有抗氧化、清除自由基、抗腫瘤、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎免疫、抗衰老等藥理學作用，在冠狀病毒引起的疾病預防與治療藥物篩選和開發中起到了重要作用[25]，特別是與的冠狀病毒COVID-19極為類似的SARS-CoV和MERS-CoV。Chiow等[26]評估黃酮類成分抗病毒活性在小鼠冠狀病毒和登革病毒感染中，發現槲皮素表現出相對較強的抗病毒活性，可以抑制冠狀病毒和登革病毒，Indra等[27]通過體內外實驗表明槲皮素可通過誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中的ERK1/2磷酸化和NF-κB活化來抑制炎癥。Chiang等[28]在體外抗病毒活性實驗中發現，槲皮素與上呼吸道感染的靶細胞和病原體（SARS-CoV）共培養時，表現出較強的抗病毒活性。Schwarz等[29]發現山奈酚及其衍生物在SARS冠狀病毒治療中，通過抑制抗冠狀病毒的3a離子通道，抑制病毒的釋放，可能成為開發新型治療性抗病毒藥物的來源。Sun等[30]通過體外和體內實驗表明山奈酚通過抑制炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2的表達，并通過MAPK和NF-κB通路抑制炎癥反應，從而改善肺部水腫。甘草通過控制病毒基因表達，誘導細胞融合等抑制病毒的復制，在抗艾滋病病毒（HIV）、SARS病毒（SARS-CoV）中廣泛作用[31]。甘草中成分甘草異黃烷酮、甘草苷是抗病毒，炎癥的有效成分，能減輕炎癥因子風暴、預防ARDS和多臟器損傷而減少炎癥性疾病重癥化，而且還具有抗病毒潛能[32-33]。

藏醫理論認為是當機體受季節、飲食、起居等外因外干擾時，體內隆、赤巴、培根三因素平衡便失調，功能發生偏盛或偏衰，導致COVID-19引起的肺炎發病。由此，可根據疫情的發展階段，采用防治結合的手段進一步控制疾病發展與轉歸。首先進行起居、飲食、藥物預防，進一步通過藥物治療，根據藏醫藥經典文獻《蓮花生醫著匯集·甘露寶瓶》記載[34]，年仍奈（即疫?。嵝圆∫哉{節平衡三因，特別針對“隆”的偏勝糾正治療。常規治療方法有三種：第一“潔靜環境、通風殺菌”，其次“軀體散熱，運動發汗，藥物下瀉”為治療方法，最后以補益性藏藥平和”隆”滋補身體”為主。

綜上所述，本研究在藏醫藥理論指導下，應用網絡藥理學和分子對接技術對藏藥五味沙棘散中活性成分、作用靶點、信號通路進行分析。體現了藏藥五味沙棘散“多成分-多靶點-多途徑”的作用特點，五味沙棘散的核心活性成分（甘草異黃烷酮、甘草苷、槲皮素、山奈酚）能通過與血管緊張素轉換酶II（ACE2）、細胞絲氨酸蛋白酶TMPRSS2和COVID-19 3CL水解酶結合作用于AKT1、PTGS2、EGFR等靶點，調節多條信號通路，從而可能達到對COVID-19的治療作用。藏醫理論與化學、分子手段相結合，可能為藏藥治療COVID-19以及后期的藥物開發提供一種新的思路。本課題組后續將采用動物體內外實驗，進一步探索藏藥五味沙棘散治療COVID-19的藥效作用及其機制，為其進一步開發利用提供更多的依據。