藿香正氣湯抑制新型冠狀病毒復制過程的有效成分及機制初探＊

杜海濤，王 平，馬青云，李 娜，丁 潔，孫鐵鋒，王從安，王丹丹，張會敏，張麗美

（1.山東中醫藥大學藥學院 濟南 250355；2.山東省中醫藥研究院 濟南 250014；3.天津大學精密測試技術及儀器國家重點實驗室 天津 300072；4.山東第一醫科大學附屬頸肩腰腿痛醫院 濟南 250062；5.山東省醫藥生物技術研究中心 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院） 濟南 250062）

新型冠狀病毒（SARS-COV-2）屬于β屬新型冠狀病毒，2019年12月于武漢華南海鮮市場首次被發現并迅速蔓延，可通過空氣傳播和接觸傳播，感染后可引起咳嗽、發熱、呼吸困難等癥狀，甚至發展為嚴重急性呼吸綜合征、腎衰竭甚至死亡[1-2]。截止2020年2月19日，已有近八萬例感染，兩千余例死亡，給世界人民的生命健康帶來了極大的威脅。新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）發病具有典型的濕毒致病特點，屬于中醫“疫病”范疇，表現為濕困脾閉肺，肺失宣降，氣郁身熱，患者多有舌苔白膩，大便稀溏，病程比一般呼吸道感染疾病更長，極易耗氣傷陰，因此宜用化濕方輔以治療。

藿香正氣湯出自《瘍醫大全》卷九，是溫中化濁的代表方，具有解表化濕、理氣和中之功效，適用于濕熱之邪積聚內阻導致氣機壅塞之癥。系列中成藥藿香正氣口服液、藿香正氣水等是《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》中表現為乏力伴腸胃不適者的推薦用藥，現已在抗疫一線初顯成效[3-6]，但這些良方通過什么作用機制達到的療效目前尚不清晰。傳統中藥復方通過多成分、多靶點對人體起到全方位的調控作用，因此本研究從分子調控出發，運用分子對接及網絡藥理學方法，尋找藿香正氣湯防控COVID-19的直接及間接作用機制，確定在機體網絡中重要靶標，為藿香正氣系列方在抗疫戰中更好的應用打下基礎。

1 材料和方法

1.1 配體準備

從中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com)中，檢索藿香正氣湯中白術、陳皮、半夏、桔梗、砂仁、藿香、紫蘇、白芷、甘草、白茯苓、厚樸的成分[7]。根據化合物在體內吸收、分布、代謝和排泄（ADME）的藥代動力學原理，以口服生物利用度(OB)≥30、類藥性(DL)≥0.18作為篩選標準[8]，下載符合篩選標準化合物的*.mol2格式文件，選用瑞德西韋作為對照藥。將文件導入Schrodinger11.9，使用“Ligprep”套件進行配體的預處理，包括互生成不同構象和使用Epik在pH 7.0±2.0下的電離態，添加氫原子，中和帶電基團，優化配體的幾何構型。

1.2 蛋白處理

從上海科技大學饒子和/楊海濤課題組獲取目標蛋白3CLpro（PDBID:6LU7）的高分辨（2.1?，0.21 nm）X射線晶體學結構。在進行分子對接之前，使用Schrodinger中的“Protein Preparation Wizard”套件來預處理原始結構：向蛋白質中添加氫原子，調整鍵序以及刪除5?以上的水分子。由于3CLpro為共結晶結構，因此使用配體結合位點來定義蛋白質的活性位點。

1.3 分子對接

使用glide（基于網格的具有能量學的配體對接）算法，對制備的大分子和配體進行超精對接。配體的結構保持柔性以產生不同的構象，OPLS力場用于執行對接計算。所有過程在Intel?Core?i7-9750 CPU@2.60 GHz,with 24 GB RAM,Windows 10 Enterprise operating system下進行。

1.4 化合物的網絡藥理學分析

將打分優于陽性藥的化合物結構上傳至SwissTargetPrediction數據庫，基于2D/3D結構相似性預測化合物在體內的靶點，選取probability＞0的靶點[9]。將預測靶點上傳至String服務器，生成蛋白相互作 用 關 系（Protein-Protein interaction,PPI），使 用Cytoscape 3.7.1可視化構建網絡，使用Network Analyzer插件分析網絡，并將度值＞0的節點定義為Hub節點并做進一步拓撲分析[10]。Hub節點蛋白經UniProt平臺轉為UniProt ID導入DAVID 6.8平臺進行基因本體論（Gene Ontology，GO）分析與京都基因與基因組百科全 書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。

表1 各成分藥獲得化合物數目

圖1 3CLpro的高分辨結構

2 結果

2.1 配體與蛋白預處理

經ADME參數篩選后的藿香正氣湯各藥符合要求的化合物數目如表1所示。去除重復化合物后累計得到183個化合物納入對接研究。經預處理在LigPrep中共生成了1894種小分子構象。處理后的3CLpro如圖1，此蛋白共有1條鏈，使用紅色表示α螺旋部分，藍色表示β折疊部分，灰色表示無規則卷曲部分，蛋白表面為灰色半透明，紅色空腔位置為配體對接活性位點。

2.2 分子對接打分

對照藥瑞德西韋分子對接得分-8.243，比對照藥瑞德西韋結合好的化合物有5個，對接得分如表2，對接得分是綜合了氫鍵、鹵素鍵、鹽橋等非共價鍵，π-π疊加、π-陽離子等π相互作用，接觸力等給出的綜合得分，值越小，說明化合物與靶蛋白的結合能力越強[11-12]。細節圖見圖2，C1-1～CD-1為3D對接模式，C1-2～CD-2為2D對接模式,CD為對照藥瑞德西韋的對接模式。

表2 分子對接打分表

2.3 網絡藥理學分析

2.3.1 靶點預測及PPI分析

在 Swiss Target Prediction平臺共預測到Probability＞0的靶點329個。在String平臺設置最小相互作用分值為0.7，并隱藏網絡中孤立節點，生成的PPI網絡共包含168個節點，706條邊，使用Cytoscape 3.7.1可視化構建網絡，并使用Network Analyzer插件分析。使用度值（Degrees）描述節點在網絡中的重要性，定義為該節點與其他相互作用的節點的個數，該網絡平均度值8.405。將大于平均度值的節點做進一步拓撲，所得PPI網絡有76個節點，454條邊，網絡中面積越大同時顏色越趨于暖色的節點相對更重要，如圖3。

2.3.2 基因富集分析

將PPI中涉及76個蛋白名轉為Uniprot ID，輸入DAVID 6.8平臺進行富集分析，設置物種為Homo sapiens，選擇富集蛋白數量前十位且P＜0.05的項目進行可視化，GO富集分析結果見圖4，KEGG富集分析結果見圖5。由此可知，BP與凋亡過程的負調控、蛋白質磷酸化、蛋白質自動磷酸化、信號轉導、細胞增殖的正調控、G蛋白偶聯受體信號通路、血小板活化、肽基-絲氨酸磷酸化、細胞分裂、有絲分裂細胞周期的G2/M轉變有關；CC與質膜、胞漿、核、胞質、膜、核質、質膜整體成分、胞外間隙、線粒體、中心體相關；MF與蛋白結合、ATP結合、蛋白激酶活性、激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白激酶結合、相同蛋白結合、蛋白酪氨酸激酶活性、酶結合、蛋白質異二聚活性相關。KEGG通路顯示，藿香正氣湯抗病毒有效化合物通過癌癥途徑、PI3K-Akt信號通路、癌癥中的蛋白多糖、RAS信號通路、細胞周期、病毒致癌等信號通路發揮作用。

圖3 PPI拓撲分析結果

圖4 GO富集分析結果

圖5 KEGG富集分析結果

3 討論

目前，除對癥支持治療之外，臨床還未批準針對COVID-19的特效藥。瑞德西韋的相關報道較多，其不能被nsp14外顯子切除，表明具有較強的體外抗病毒活性，在美國已有一例治愈病例[13-14]。但瑞德西韋在人體內抗SARS-COV-2的有效性和安全性尚未得到證實，在臨床使用中仍需謹慎。

本研究以抗病毒有效方藿香正氣湯為研究對象，以化學藥物瑞德西韋為陽性對照，通過篩選來自方中183種化合物，預測直接抑制SARS-COV-2復制的機制。3CLpro是一種半胱氨酸蛋白酶，是介導復制酶多肽1a和1ab水解的功能蛋白，參與病毒復制和增殖過程[15]。結合抗SARS的經驗，3CLpro因其基因具有高度的保守性，且在冠狀病毒的復制過程產生RNA依賴性RNA聚 合 酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp），因此，可作為藥物設計的關鍵靶標，為抗SARS-COV-2藥物的研發提供突破口[16-19]。直接抑制病毒復制過程是中藥抗病毒的重要途徑之一[20]，從分子對接結果來看，藿香正氣湯中5個成分與SARSCOV-2 3CLpro結合較好，得分優于對照藥瑞德西韋。其中C2具有抗氧化、清除自由基、抗炎、促進碳水化合物代謝、調節免疫系統等活性[21]。據報道，C2可將感染細胞中的丙型肝炎病毒（HCV）復制降低80%，且刺激24h后原代人肝細胞中ApoB的分泌量表示化合物具有低肝毒性[22]。Silvia Schwarz等[23]發現C4是冠狀病毒復制和釋放相關的3a離子通道的抑制劑并且能干擾病毒生命周期過程。從化合物結構來看，C1-C5都含有黃酮母核，屬黃酮類化合物，現該類化合物已被報導具有廣泛的抗菌抗病毒作用，具有進一步開發為3CLpro抑制劑的價值[24]。Seri Jo等[25]通過分子對接及蛋白水解法、色氨酸熒光法驗證，發現黃酮類化合物（尤其是黃酮醇類）具有疏水性芳環和親水性羥基，能與SARS-CoV 3CLpro活性位點完美親和，并有效阻斷3CLpro的活性使其失去原本調控復制的能力。

通過網絡藥理學富集分析結果可看出，前六條通路多和腫瘤、病毒及細胞過程相關。值得注意的是，其中25個基因富集于PI3K-Akt信號通路。已有多項報道已表明，PI3K-Akt信號通路在SARS-CoV和MERS-CoV的感染過程中起到重要作用，并可能作為抵御冠狀病毒的藥物靶標[26]。因此，我們推測藿香正氣湯在體內可以通過作用于PI3K-Akt信號通路進而影響細胞因子，實現對病毒入侵人體后的干預。有研究表明，病毒可以調節宿主細胞的信號網絡使得環境更加適宜自己生存和繁殖，例如，人類乳頭瘤病毒（HPV）、粘液瘤病毒能夠持續刺激Akt，從而激活mTORC1以啟動病毒復制[27-28]。Jason Kindrachuk等[29]發現，Huh7細胞經PI3K/Akt/mTOR的靶向激酶抑制劑處理后顯著抑制了MERS-CoV的復制。Tetsuya Mizutani等報道了在感染SARS-CoV的細胞中PI3KAkt信號通路被激活以逃避細胞凋亡過程[30]。PI3K或其下游信號Akt的一些抑制劑可阻斷病毒進入和復制過程[31-32]。

從《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》中可以看出，臨床表現乏力伴腸胃不適者，推薦使用藿香正氣相關中成藥。藿香正氣湯出自《瘍醫大全》卷九，用于疏風寒、消飲食等暑濕癥狀。本研究結果也顯示，藿香正氣湯直接作用的有效化合物C1-C5多出自甘草、陳皮、桔梗，方中這幾位藥也兼具理氣健脾，宣肺利咽等“扶正”功效，即能通過直接抑制病毒復制發揮“驅邪”，也能通過調控PI3K-Akt信號通路發揮“扶正”功效，強自身正氣并驅邪外出，雙管齊下，使病情好轉。

但也應當注意，現在受制于對病毒認識和染病機制的不足，計算機預測方法及數據庫數據可靠性等自身局限性的影響，虛擬對接和網絡藥理學預測可能會存在預測結果與實際不符的情況。針對這個問題，課題組認為我們應結合中醫藥在防治SARS等方面的經驗開展進一步的驗證和優化，以便更好服務戰疫前線。