胃癌患者常見舌苔類型與腸道菌群的相關性分析＊

孫 嫻，向春婕，徐 碩，吳 娟，王瑞平，詹 瑧，張軍峰＊＊

（1.南京中醫藥大學醫學院 南京 210023；2.江蘇省中醫院腫瘤內科 南京 210029）

舌苔乃胃蒸脾濕上潮而生，《辨舌指南》[1]周序：“四診以望居先，望者何？察面色，觀目神，辨舌苔，驗齒垢四者而已。四者之中，尤以辨舌為最重要。”惲鐵櫵在《病理雜談》論及舌苔與病候時，提出“舌苔乃胃腸消化工作強弱與正常、反常之標幟”[2]。這些中醫臨床理論表明，舌苔變化可以反映脾胃功能，反映消化道病理生理變化，即舌為脾胃之外候、舌為脾胃之鏡[3]。近年來，腸道菌群在健康和疾病中的特征和變化受到廣泛關注。臨床研究發現，腸道菌群失調是脾虛證的重要特征[4]，健脾方劑的藥理作用與調節腸道菌群相關[5]；前期研究發現，健脾養胃治法可以顯著改善化療胃癌患者生活質量，與腸道菌群改變相關[6]，這些研究提示腸道菌群是中醫脾藏象的功能執行者。

中醫認為，胃主受納，脾主運化，“脾為胃行其津液”，脾胃協同完成消化吸收和精微物質的全身輸布功能，參與整體的生理代謝調節，故脾胃為后天之本。在消化道中存在大量微生物，消化道微生物是不僅參與消化吸收功能，而且通過短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸等）、氨基酸（色氨酸、酪氨酸等）代謝參與機體的整體生理調節[7]。隨著微生物非培養依賴的高通量測序技術發展，大量研究發現，在消化系統惡性腫瘤（胃癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌等）、代謝性疾病（糖尿病、高血壓、冠心病等）、退行性疾病（帕金森病、骨質疏松等）等疾病發生時，腸道菌群也發生顯著的變化，因此，腸道菌群是反映機體內環境穩定的“一面鏡子”[8-9]。最新的薈萃分析顯示，從口腔到腸道微生物群落結構具有顯著的部位特征，當疾病（類風濕關節炎、糖尿病、結直腸癌）發生時，更多的口腔菌群進入腸道而成為疾病風險標志菌群[10]。舌苔菌群是口腔菌群的重要聚集地，有學者推測常見舌苔對應的口腔菌群變化可能與腸道菌群存在特征性對應關系[11]，而且前期研究發現胃癌患者舌苔菌群參與舌苔變化[12-14]。因此，本研究以胃癌為基礎，分析常見舌苔對應的腸道菌群結構特征，以期為理解舌苔與脾胃功能的功能聯系提供微生態學依據。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

本研究經江蘇省中醫院臨床倫理委員會批準（2015NL-016-01），遵守臨床倫理學規范，知情同意并簽字，2015年1月至2016年12月，在江蘇省中醫院和揚中市人民醫院招募病理確診的102例原發性胃癌患者作為病例組，根據舌苔類型共分為4組：薄白苔組34例（平均年齡59.4±7.6歲，男性25例，女性9例），白厚苔組31例（平均年齡61.9±10.0歲，男性23例，女性8例），黃薄苔組20例（平均年齡66.8±7.6歲，男性14例，女性6例），黃厚苔組17例（平均年齡70.6±7.0歲，男性14例，女性3例）。同期，在江蘇省中醫院體檢中心收集招募體檢無重大器質性病變的薄白苔體檢者24例作為對照組，男16例，女8例，平均年齡62.7±6.5歲。5組人群的年齡、性別均無顯著性差異（P＞0.05）。

1.2 舌苔類型判定

參照中醫舌診規范[15]，晨起空腹，無菌水漱口2-3次后，用DS01-B舌象儀采集圖像（上海道生醫療科技有限公司，上海）采集舌象并判斷苔色和苔質，排除染苔，并由兩位中醫師對舌苔的苔色和苔質進行辨識。

1.3 糞便菌群檢測與分析

收集胃癌患者和對照組糞便，-80℃保存。菌群檢測參照文獻[12]。簡述如下：利用DNA提取試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，USA）提取糞便DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量符合要求。細菌16SrRNA基因可變區V3-V4的通用引物為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），真菌18SrRNA基因ITS1-2區的通用引物為ITS1F 5'-barcode-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'和ITS2R 5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'。然后利用PCR儀（ABI GeneAmp?9700型）進行擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，AxyPrepDNA試劑盒（AXYGEN公司）回收PCR產物，QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統（Promega公司）進行DNA定量分析，構建Illumina PE250文庫，利用Illumina Miseq平臺進行高通量測序。測序數據采用QIIME（version 1.17）進行數據優化處理，采用UPARSE35（version 7.1 http://drive5.com/uparse/）軟件按照97%相似性建立菌群可操作單元（operational taxonomic unit，OTU），并 分 別 在 門（phylum）、綱（class）、目（order）、科（family）、屬（genus）等分類水平分析菌群結構。采用在線軟件（http://www.i-sanger.com）和Visual Genomics（Release 1，上海盈飛生物）進行微生態學生物信息分析，包括α多樣性、菌群結構分析、LEfSe分析等。

1.4 統計學分析

數據資料采用平均值±標準差表示，統計學方法包括卡方檢驗、非參數檢驗、受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析和Spearman相關性分析，所有統計分析在SPSS 21.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，USA）進行，R軟件包（pheatmap，https://www.rproject.org/）繪制相關性熱圖，采用雙側檢驗，P＜0.05為顯著統計學意義。

2 結果

2.1 常見胃癌患者對應腸道菌群的Alpha多樣性

Alpha主要關注腸道菌群的物種數目和多樣性，Ace和Chao反映物種的豐富度，Shannon和Simpson反映物種的多樣性。采用Mann-Whitney U非參數檢驗腸道菌群的alpha多樣性指數差異，結果（見表1）顯示，與對照組相比，腸道細菌多樣性指數均無統計學差異（P＞0.05），黃薄苔胃癌患者腸道真菌多樣性（Shannon指數）顯著降低（P＜0.05），而黃厚苔胃癌患者真菌豐富度（Ace指數）顯著降低（P＜0.05）。在胃癌患者內部，四種舌苔對應的腸道細菌多樣性均無顯著統計學差異（P＞0.05）；與其他3種舌苔相比，白厚苔胃癌患者腸道真菌豐富度顯著升高（P＜0.05），而黃厚苔胃癌患者腸道真菌豐富度顯著降低（P＜0.05）。

表1 胃癌患者常見舌苔對應腸道菌群Alpha多樣性分析

2.2 常見舌苔胃癌患者對應腸道菌群的結構分析

本研究人群腸道觀察到已知細菌有17個門、25個綱、53個目、94個科和325個屬。4個優勢菌門總計占96%，從高到低依次為厚壁菌門（Firmicutes，60.3±18.9%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，16.5±15.8%）、變形菌 門（Proteobacteria，16.0±16.1%）、放 線 菌 門（Actinobacteria、3.6±4.2%）。相對豐度大于1%的優勢菌屬有5個，從高到低依次為擬桿菌屬（Bacillus，8.6±10.3%）、乳桿菌屬（Lactobacillus，8.3±14.6%）、大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella，6.9±11.7%）、糞桿菌屬（Faecalibacterium、5.5±7.7%）和鏈球菌屬（Streptococcus，5.3±6.2%）。

本研究人群腸道觀察到已知真菌有7個門、26個綱、79個目、179個科和387個屬。3個優勢菌門總計占98%以上，依次為子囊菌門（Ascomycota，75.9±25.9%）、擔子菌門（Basidiomycota，19.4±26.6%）和接合菌門（Zygomycota，2.8±5.6%）；相對豐度大于1%的優勢菌屬有5個，從高到低依次為念珠菌屬（Candida，21.2±31.7%）、曲霉屬（Aspergillus，16.0±17.4%）、靈芝菌屬（Ganoderma，4.9±20.0%）、青霉屬（Penicillium，3.6±6.8%）和頂生菌屬（Acremonium，3.2±7.7%）。

在門和屬水平采用Mann-Whitney U非參數檢驗分析4種舌苔胃癌患者對應腸道菌群差異，展示至少1種舌苔胃癌患者與對照組存在顯著差異的腸道菌群（P＜0.05）。與對照組相比，不同舌苔的胃癌患者腸道細菌6個門和25個屬存在顯著統計學差異（表2），擬桿菌門（Bacteroidetes）和互養菌門（Synergistetes）的相對豐度在4種舌苔的胃癌患者腸道中均顯著升高（P＜0.05），乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、韋榮菌屬（Veillonella）、金字塔桿菌屬（Pyramidobacter）的相對豐度在4種舌苔的胃癌患者腸道中均顯著升高（P＜0.05），而羅布西亞菌屬（Romboutsia）的相對豐度在4種舌苔的胃癌患者腸道中均顯著降低（P＜0.05）。然而，與對照組相比，不同舌苔的胃癌患者有1個門和8個屬存在顯著統計學差異（P＜0.05）（表3），未發現4種舌苔的胃癌患者腸道中均顯著差異的菌群。

可以看出，與對照組相比，胃癌患者腸道菌群變化不僅與胃癌相關，而且與舌苔類型相關，提示不同舌苔類型可能對應特定腸道菌群。

2.3 胃癌患者常見舌苔對應腸道菌群的判別分析

為了排除胃癌對舌苔對應腸道菌群的影響，本研究將胃癌患者分為目標舌苔組和其他3種舌苔合并組，采用LEfSe判別分析，目標舌苔組對應菌群是相對豐度升高的腸道菌群，其他3種舌苔組對應的標志菌群是目標舌苔組相對豐度降低的腸道菌群（圖1）。譬如，與其他3種舌苔相比，薄白苔胃癌患者腸道中α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、產堿桿菌科（Alcaligenaceae）、巨單胞菌屬（Megamonas）、嗜糞擬桿菌（Bacteroidescoprophilus）等20個細菌分類單元相對豐度顯著升高（圖1A），薄白苔胃癌患者腸道中子囊球菌綱（Ascosphaerales）、節擔菌目（Wallemiales）、囊球菌目（Ascosphaeraceae）、囊球菌屬（Ascosphaera）、蜜蜂球囊菌種（Ascosphaera apis）等28個真菌分類單元相對豐度顯著升高（圖1E）。

表3 常見舌苔胃癌患者腸道真菌比較分析（相對豐度‰，均值±標準差）

為了進一步探索胃癌患者常見舌苔對應腸道菌群的診斷價值，采用ROC分析不同舌苔對應腸道標志菌群，曲線下面積（Area under curve，AUC）大于0.7可以作為標志菌群，結果顯示，奇異菌屬（Atopobium）顯著升高與胃癌患者白厚苔相關，AUC（95%CI）為0.708（0.601-0.815）；Ruminococcaceae UCG-004菌 屬 和Lachnospiraceae UCG-006菌屬顯著升高與胃癌黃厚苔相關，AUC（95%CI）分別為0.740（0.597-0.883）、0.715（0.574-0.856）；然而，未發現與胃癌患者薄白苔、黃薄苔相關的標志腸道菌群。

2.4 胃癌患者常見舌苔相關血清炎癥因子比較分析

前期研究發現，黃苔胃癌患者血清IL-17α水平顯著高于白苔患者，而且在對照人群也具有同樣結果，提示血清IL-17α是區分白苔和黃苔的潛在指標[16]。最新研究發現，腸道菌群與機體炎癥因子的產生能力相關，TNF-α和IFN-γ與腸道菌群的棕櫚酸和色氨酸代謝途徑相關[17]。因此，本研究對前期血清炎癥因子數據進行了再次分析，結果顯示，與薄白苔對照組相比，薄白苔胃癌患者血清IL-1α、IL-5、TNF-β、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8和IL-13水平均顯著降低（P＜0.05），胃癌患者白厚苔患者血清IL-5、IL-17α水平顯著升高（P＜0.05），而血清IL-4、IL-8、IL-13水平顯著降低（P＜0.05），黃薄苔胃癌患者血清IL-12/IL-23P40、IL-17α水平均顯著升高（P＜0.05），黃厚苔胃癌患者血清IL-15、IL-17α水平均顯著升高、TNF-β、VEGF、IL-4水平均顯著降低（P＜0.05）（表4）。

2.5 胃癌患者常見舌苔對應腸道菌屬與血清炎癥相關性分析

為了進一步探討常見舌苔胃癌患者差異腸道菌群與血清炎癥因子的相關性，本研究結合胃癌患者常見舌苔相關腸道細菌（表2）、腸道真菌（表3）和血清炎癥因子（表4），在每種舌苔胃癌患者和對照組人群中，對相關差異菌屬和炎癥因子進行Spearman相關分析。結果顯示，血清炎癥因子的變化趨勢與腸道菌屬相對豐度的變化趨勢存在一致性，即血清水平顯著升高的炎癥因子與相對豐度升高的腸道菌群顯著正相關，而血清水平顯著降低的炎癥因子與相對豐度升高的腸道菌群顯著負相關，反之亦然（圖2）。

對于薄白苔胃癌患者，血清水平下降的IL-5與相對豐度升高的韋榮球菌屬（Veillonella）顯著負相關（相關系數r=-0.364），血清水平下降的IL-2與相對豐度降低的糞桿菌屬（Faecalibacterium）顯著正相關（r=0.370），血清水平下降的IL-13與相對豐度升高的副桿菌屬（Parabacteroides）、鏈球菌屬（Streptococcus）均顯著負相關（r=-0.390，-0.385）（圖2A）。對于白厚苔胃癌患者，血清水平升高的IL-17α與相對豐度升高的乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬、金字塔桿菌屬（Pyramidobacter）均顯著正相關（r=0.461，0.385和0.385），而血清水平降低的IL-8與相對豐度降低的[Eubacterium]hallii group顯著正相關（r=0.408）（圖2B）。對于黃薄苔胃癌患者，血清水平升高的IL-17α與相對豐度升高的乳桿菌屬、鏈球菌屬、韋榮球菌屬、巨球菌屬（Megasphaera）、擬桿菌屬（Bacteroides）、梭桿菌屬（Fusobacterium）均顯著正相關（r=0.525，0.410，0.387，0.362，0.387，0.402），與相對豐度降低的支原體屬（Romboutsia）顯著負相關（r=-0.496），血清水平升高的IL-12/IL-23P40與相對豐度升高的乳桿菌屬顯著正相關（r=0.605）（圖2C）。對于黃厚苔胃癌患者，血清水平升高的IL-17α與相對豐度升高的乳桿菌屬、異普雷沃菌（Alloprevotella）顯著正相關（r=0.403，0.375），與相對豐度降低的Romboutsia顯著負相關（r=-0.432），血清水平降低的VEGF與相對豐度升高的韋榮球菌屬、異普雷沃菌顯著負相關（r=-0.414，-0.397）（圖2D）。

圖2 胃癌常見舌苔對應腸道差異菌屬與血清炎癥因子的相關性分析

可以看出，不同舌苔的胃癌患者具有不同的腸道菌群-炎癥因子互作模式，其中，IL-17α在白厚苔、黃薄苔和黃厚苔胃癌患者血清中均顯著升高，均與腸道乳桿菌屬的相對豐度正相關。

3 討論

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，2015年我國胃癌新發67.9萬例，死亡49.8萬例，發病率居惡性腫瘤第2位，死亡率居第3位，嚴重威脅國人健康[18]。中醫藥辨證論治輔助胃癌治療可以顯著提高胃癌患者生活質量，而舌苔是辨證論治的重要內容[19]。因此，揭示不同舌苔對應的腸道菌群結構特征，對理解舌苔形成的生物學機制及臨床診斷價值提供新的視角。本研究發現，與對照組相比，不同舌苔的胃癌患者均表現為擬桿菌門、梭桿菌門相對豐度顯著升高，放線菌門、厚壁菌門、變形菌門相對豐度顯著降低，類似于胰腺癌和結直腸癌患者腸道菌群結果[20-21]，不同舌苔的胃癌患者腸道乳桿菌屬、鏈球菌屬的相對豐度顯著升高，而糞桿菌屬的相對豐度顯著降低，與結直腸癌患者腸道菌群特征類似[22-23]。然而，不同舌苔的胃癌患者腸道真菌均表現為頂生菌屬相對豐度顯著升高，作為一類腐敗真菌，頂生菌屬在免疫功能低下時可導致感染[24]，提示胃癌患者免疫功能低下。同時，本研究也發現對于不同舌苔的胃癌患者的差異腸道菌群不完全相同，表明不同舌苔對應的腸道差異菌群不僅與胃癌相關，也與舌苔類型相關。

為了探討胃癌患者常見舌苔對應的標志菌群，對4種常見舌苔的胃癌患者腸道菌群進行LEfSe判別聯合ROC診斷曲線分析。結果發現，與其他3種舌苔胃癌患者相比，白厚苔胃癌患者腸道奇異菌屬相對豐度顯著升高，黃厚苔胃癌患者的腸道反芻球菌科（Ruminococcaceae）UCG-004菌屬、毛螺菌科UCG-006菌屬、Anaerotruncus colihominis DSM 17241菌種和Halomonasstevensii菌種相對豐度顯著升高，而薄白苔和黃薄苔胃癌患者未發現具有診斷價值的標志菌群，提示白厚苔和黃厚苔胃癌患者具有獨特的腸道菌群。

奇異菌屬革蘭染色陽性，臨床研究發現，結直腸癌患者腸道奇異菌屬的相對豐度顯著升高[25]，缺血性中風患者腸道奇異菌群（Atopobium cluster）和乳酸桿菌（Lactobacillusruminis）顯著升高，而日本2型糖尿病患者腸道奇異菌屬豐度顯著降低[26]，提示腸道奇異菌屬相關炎癥代謝通路是胃癌患者白厚苔形成重要因素。

毛螺菌科是人類腸道的優勢菌群，革蘭染色陰性，嚴格厭氧[27]，毛螺菌科可以產生丁酸鹽參與機體的新陳代謝，如毛螺菌科的腸道定植可以誘導小鼠糖尿病[28]，而且丁酸可以顯著促進脂肪代謝和蓄積[29]，而黃厚苔胃癌患者腸道毛螺菌科UCG-006菌屬顯著高于其他舌苔患者，提示黃厚苔胃癌患者可能存在脂肪代謝紊亂。另外，臨床研究發現，終末期腎病患者腸道鹽單胞菌科（Halomonadaceae）相對豐度顯著升高[30]，而本研究中發現黃厚苔胃癌患者腸道鹽單胞菌科的Halomonasstevensii相對豐度顯著升高，提示黃厚苔胃癌患者可能與腎臟水鹽代謝功能異常相關。

眾所周知，微生物是感染的重要因素，血清炎癥因子水平可以反映機體的炎癥免疫狀態，本研究結合前期研究結果[16]，發現白厚苔、黃薄苔和黃厚苔胃癌患者血清IL-17α水平均顯著升高，而且與腸道乳桿菌屬的相對豐度顯著正相關。IL-17α具有募集中性粒細胞、促進抗體生成、活化T細胞等活性，是黏膜免疫的重要調節分子[31]，血清IL-17α在結腸結扎和穿刺誘導的大鼠敗血癥模型中顯著升高，與活性氧（reactive oxygen species）介導的信號轉導通路相關[32]，也參是調控腸道菌群抵抗肺真菌感染的關鍵細胞因子[33]，這些研究結果提示IL-17α是消化道黏膜菌群參與炎癥免疫的重要分子。乳桿菌屬于人類腸道正常微生物群，革蘭陽性菌，微需氧，過氧化氫酶陰性，廣泛存在于糞便、尿道、血液、呼吸道、創口、分泌物等樣本，與機會感染相關[34]，結果提示血清IL-17α升高可能與腸道乳桿菌的機會感染相關。

綜上所述，本研究發現胃癌患者常見舌苔類型與腸道菌群相關，不同舌苔對應了特定的腸道菌群結構，為理解舌苔反映腸道病理生理功能提供了微生態學視角，特別是發現白厚苔和黃厚苔具有特定的標志腸道菌群，為深入研究胃癌患者舌苔形成分子機制提供了新的思路。本研究也存在一定局限：舌苔形成受到許多復雜因素的影響，是機體病理生理的綜合外在表現，胃癌患者的病理類型、藥物治療和飲食習慣也會對本研究結果產生干擾，因此，需要更大的人群或其他消化道疾病人群進行驗證，才能獲得具有更可靠的結果。無論如何，本研究為開展中醫舌診特別是舌苔的生物學原理研究提供了新的思路和方法，有助于促進中醫舌診的客體化和標準化。