健脾合劑對脾虛腹瀉型腸易激綜合征小鼠腸道菌群的干預(yù)研究＊

連秋華，朱惠萍，梁國強，張 川，丁姮月，孫宏文＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 南京 210000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院蘇州 215000；3.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院吳門醫(yī)派研究院 蘇州 215000）

腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）作為一種功能性腸病，以腹痛、腹脹不適伴有排便習(xí)慣、大便性狀改變?yōu)樘卣鳌Ｔ摬“l(fā)病率較高，對患者的生活質(zhì)量及社交活動有明顯的負(fù)面影響，關(guān)于該疾病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，當(dāng)前認(rèn)為該疾病的發(fā)病因素主要以遺傳因素、胃腸道功能異常、內(nèi)臟高敏性、腸道炎癥與免疫功能障礙、腦-腸軸反饋異常為主[1]。既往傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為，IBS是一種功能性腸病，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)IBS的發(fā)病模式是一種免疫-炎癥模式，其病理狀態(tài)是微生物導(dǎo)致的腸道局部、持續(xù)、低級別的炎癥反應(yīng)。在我國醫(yī)學(xué)中，根據(jù)IBS-D的臨床表現(xiàn)可歸屬為“泄瀉”、“腹痛”等范圍。中醫(yī)認(rèn)為，泄瀉的基本病機(jī)為脾虛濕盛，其病位在腸，主病之臟屬脾。其中，脾虛型是IBS-D的主要證型，健脾在IBS-D的中醫(yī)治療中占有重要的地位。近年的研究顯示對IBS尤其是IBS-D用藥以健脾化濕藥物為主[2]。有文獻(xiàn)報道，加味四君子湯可改善脾虛型IBS-D患者的主要癥狀，作用慢但效果優(yōu)，且效率穩(wěn)定，值得臨床推薦[3]。四君子湯能顯著提高脾虛小鼠腸道內(nèi)的菌群多樣性,尤其有助于雙岐桿菌和乳桿菌的恢復(fù)[4]。

目前，對腸道微生態(tài)與疾病關(guān)系的研究方法主要包括：傳統(tǒng)的糞便細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、溫度變性梯度凝膠電泳（TGGE）、實時定量熒光PCR，以及靈敏度很高的高通量測序和全基因組測序等。本文運用四君子湯加味制成的健脾合劑治療脾虛腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）小鼠，而后采用16SrDNA高通量基因測序法觀察、分析健脾合劑對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的干預(yù)作用。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗動物

1.1.1 分組

選擇清潔級幼齡ICR雄性小鼠48只，體重（20±2）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為四組（n=12）：空白組、模型組、西藥組、中藥組。

1.1.2 造模

造模前每日定時觀察記錄小鼠大便性狀改變，飲食情況，測量體重，記錄一般情況。對空白組以外的三組小鼠予以100%番瀉葉冰水浸液以10 ml/kg小鼠體積灌胃，每天2次，連續(xù)10天，期間喂食不定時，制定脾虛型IBS-D模型。

1.1.3 IBS-D動物模型標(biāo)準(zhǔn)[5]

主癥：①泄瀉嚴(yán)重，甚至脫肛；②食少，納呆。次癥：①消瘦、體重減輕；②神態(tài)萎靡，四肢不收，毛色枯槁；③蜷縮聚堆；④易疲勞。當(dāng)具備其中兩項主癥，兩項次癥即可確認(rèn)脾虛型IBS-D造模成功。

1.2 實驗用藥

本實驗用藥具體如下：

健脾合劑：蘇州市中醫(yī)醫(yī)院自制制劑（組方黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草、陳皮、山藥），批號：171205。

復(fù)合乳酸菌膠囊：江蘇美通制藥有限公司，批號：180106。

戊巴比妥鈉：上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠提供（sigma公司生產(chǎn)），批號：20089104。

番瀉葉（統(tǒng)貨，廣東）：蘇州市春輝堂藥業(yè)有限公司，批號：170909。

1.3 給藥方法

模型復(fù)制評價成功后，空白組、模型組兩組以雙蒸水10 ml·kg-1的體積灌胃。西藥組以10 ml·kg-1的體積灌胃復(fù)合乳酸菌（0.026 g·ml-1的混懸液），即0.26 g·kg-1小鼠；中藥組以16 ml·kg-1體積灌胃健脾合劑藥液，給藥周期均為14天。

1.4 觀察及檢測指標(biāo)

1.4.1 大便性狀、體重、飲食的記錄

在實驗期間，每天定時記錄造模前后小鼠的大便性狀、飲食及體重。

1.4.2 小鼠腸道菌群的檢測

標(biāo)本的采集：無菌操作置于干凍管中，放置于-80°的冰箱保存。

樣本的標(biāo)記：空白組、模型組、西藥組及中藥組治療后糞便分別標(biāo)記為B1、B2、B3、B4。

標(biāo)本的處理：取出冷藏的樣本，常溫復(fù)溶。稱取樣本重量；勻漿的比例為10%（即1 g糞便加9 ml勻漿液）；勻漿液選取PBS（PH=7.2-7.4，濃度為0.01 mol/L）；采用組織勻漿器，冰浴上勻漿；離心轉(zhuǎn)速選用5000轉(zhuǎn)/分，時間為15 min，取上清液待檢。

1.5 實驗方法

對所有樣本進(jìn)行miseq文庫制備（基因組DNA提取，PCR擴(kuò)增，AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收，及FTC-3000 TM real-time PCR儀進(jìn)行實時熒光定量），然后進(jìn)行16SrDNA高通量測序，根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計及處理

采用R3.4.1語言作圖軟件剖析腸道菌群；SPSS 22進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)在圖中以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）的形式繪制。采用wilcox、Ttest分析比較各組之間的差異。當(dāng)P＜0.05時可判斷為具有差異顯著性。

2 實驗結(jié)果

2.1 大便性狀、體重、進(jìn)食量的記錄

每天監(jiān)測并記錄小鼠大便性狀、進(jìn)食量，可知中藥組、西藥組在給藥后，泄瀉情況都有所好轉(zhuǎn)，模型組小鼠糞便依然偏稀、不成形，毛發(fā)灰暗，性情躁動。中藥組、西藥組毛發(fā)相對模型組毛發(fā)、行為狀態(tài)有所改善。西藥組糞便在7天后開始正常，中藥組的糞便成形但是水分較多。監(jiān)測并記錄小鼠體重后經(jīng)統(tǒng)計后得出表1：在給藥第7天、第14天中藥組、西藥組體重均高于模型組，中藥組、模型組比較具有顯著性差異（P＜0.05）；給藥第7天、第14天中藥組、西藥組體重在均低于空白組且具有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 各組實驗過程中各階段的體重變化比較n=12

表1 各組實驗過程中各階段的體重變化比較n=12

注：與空白組比較*P＜0.05，與模型組比較#P＜0.05。

組別空白組模型組西藥組中藥組劑量/kg 時相點體重/g給藥第1天26.0±1.6 23.8±1.1(*)23.4±1.0(*)24.3±1.2(*)--0.26 g 16 ml（50%）給藥第14天37.3±1.4 33.3±1.4(*)34.4±1.4(*)34.9±2.1(*#)給藥第7天31.6±2.3 27.0±1.8(*)28.3±1.2(*)29.4±1.8(*#)

圖1 20例樣本細(xì)菌DNA電泳圖

圖2 20例樣本的稀釋性曲線

圖3 20例樣本的豐度等級圖

2.2 樣本的基因DNA質(zhì)控

采用QIAamp DNA Stool Mini Ki方法對樣本進(jìn)行基因組DNA提取，然后分別取3μL進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果圖1，成像后得到的條帶，清晰單一，片段長度與預(yù)期片段一致，且濃度適中，負(fù)對照無污染，表明提取的樣品DNA完整度良好。

2.3 四組小鼠的DNA測序序列結(jié)果分析

2.3.1 四組小鼠腸道菌群多樣性的分析

本次測序是對≥97%水平的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計分析，為了驗證測序數(shù)據(jù)量是否充分以反映樣品物種多樣性，使用mothur軟件進(jìn)行稀釋性曲線（Rarefaction curve）的繪制（見圖2）。

稀釋曲線是用來評價測序量是否合理。曲線越平緩，表明測序深度越充分；反之，則表明仍存在較多未被測序檢測到的物種。從圖2可以看出，所有測序量在1000左右出現(xiàn)了明顯的轉(zhuǎn)折點，而后進(jìn)入平臺期，表明測序已趨于飽和，增加測序數(shù)據(jù)無法再找到更多的OTU，本次測序深度充分，樣品均具有較好的豐富度。

為了驗證本次樣品細(xì)菌的多樣性達(dá)到本次實驗的要求，進(jìn)行了豐度等級圖（Rank-Abundanc）的繪制（見圖3），豐度等級圖主要反映樣品多樣性的兩個方面：樣品所含物種的豐富程度、均勻程度。曲線越寬，則物種豐富程度越高；曲線越平緩，則物種均勻程度越高。從圖3可以看出，大部分樣品的曲線水平方向較寬，下降趨勢較平緩，說明20例樣本中細(xì)菌的豐度和均勻度都較為合理。

2.3.2 各組小鼠腸道生物多樣性的對比

生物多樣性主要采用基于OTU聚類結(jié)果進(jìn)行Alpha多樣性分析的方法，Alpha多樣性包括chao指數(shù)（見圖4）、ace指數(shù)（見圖5），shannon指數(shù)（見圖6）以及simpson指數(shù)（見圖7）等。其中，chao指數(shù)、ace指數(shù)主要解釋樣品中群落的豐富度，而shannon指數(shù)、simpson指數(shù)解釋群落的多樣性。使用單因素方差分析方法從chao指數(shù)、ace指數(shù)、shannon指數(shù)、simpson指數(shù)四個方面比較。結(jié)合圖4、圖5、圖6、圖7可以看出這20例樣本中生物物種豐富度及多樣性均較高。

根據(jù)四組小鼠之間的差異，分別繪制了柱狀圖（見圖8），從圖8中可以看出B1、B3、B4組物種的豐富度及多樣性比B2組高（P＜0.05）；B1、B3、B4相比，物種的豐富度及多樣性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 20例樣本的chao指數(shù)曲線

圖5 20例樣本的ace指數(shù)曲線

圖6 20例樣本的shannon指數(shù)曲線

圖7 20例樣本的simpson指數(shù)曲線

2.3.3 四組小鼠腸道菌群的物種信息及差異分析

根據(jù)物種信息分類學(xué)分析結(jié)果可知，一個或數(shù)個樣品在不同生物學(xué)分類水平上的對比情況。采用統(tǒng)計學(xué)方法，觀測并分析樣品在門、綱、目、科、屬、種這6個不同生物種類水平上的群落結(jié)構(gòu)。

2.3.3.1 四組小鼠腸道菌群門水平上的分布及差異根據(jù)檢測結(jié)果，除了未分類的菌門，治療后小鼠門水平上相對豐度最大的前九個門分別是：Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria、Verrucomicrobia、Saccharibacteria、Deferribacteres、Actinobacteria、Tenericutes、Cyanobacteria。經(jīng)物種差異分析后統(tǒng)計得出表2。觀察表2可知，B1、B2相比，B2組Proteobacteria、Verrucomicrobia豐度上調(diào)（P＜0.05）；Firmicutes、Saccharibacteria、Tenericutes、Cyanobacteria豐度下調(diào)（P＜0.05）。B2、B3相比，B3組Bacteroidetes、Saccharibacteria、Tenericutes、Actinobacteria豐度上調(diào)（P＜0.05）；Proteobacteria、Verrucomicrobia豐度下調(diào)（P＜0.05）。B2、B4相比，B4組Tenericutes、Actinobacteria、Saccharibacteria豐度上調(diào)（P＜0.05）；Proteobacteria豐度下調(diào)（P＜0.05）。B3、B4組相比，各優(yōu)勢菌門均無明顯差異（P＞0.05）。

圖8 四組間樣本Alpha多樣性指數(shù)差異分析

表2 四組小鼠樣本在門水平的物種差異分析

2.3.3.2 各組小鼠腸道菌群在屬水平上的分布及差異 在屬水平上進(jìn)行四組小鼠腸道菌群的比較，一共獲得126種菌屬。其中擁有較高豐度的菌屬是：Unclassified、Bacteroides、Helicobacter、Akkermansia、Alistipes、Lactobacillus、Escherichia、Anaerotruncus、Parasutterella、Mucispirillum、Erysipelatoclostridium等。通過組間群落顯著性差異分析（Metastats），選擇P＜0.05的物種進(jìn)行三線表的繪制（見表3）。由表3可知，B1、B2相比，B2組Bacteroides、Parasutterella、Escherichia、Erysipelatoclostridium、Akkermansia、Parabacteroides、Candidatus-Stoquefichus、Anaerofustis豐 度 上 調(diào)（P ＜0.05）；Alistipes、Ruminiclostridium、Candidatus-Saccharimonas、Rikenella、Desulfovibrio、Intestinimonas、Roseburia、Lachnoclostridium、Oscillibacter、Ruminococcus、Coprococcus、Peptococcus豐度下調(diào)（P＜0.05）。B2、B3相比，B3組Alistipes、Ruminiclostridium、Candidatus-Saccharimonas、Rikenella、Desulfovibrio、Intestinimonas、Roseburia、Lachnoclostridium、Oscillibacter、Blautia、Ruminococcus、Coprococcus、Enterorhabdus、Parvibacter、Peptococcus、Syreptococcus、Papillibacter豐度上調(diào)（P＜0.05）；Lactobacillus、Bacteroides、Parasutterella、Escherichia、Erysipelatoclostridium、Akkermansia、Caproiciproducens、Parabacteroides、Candidatus_Stoquefichus豐度下調(diào)（P＜0.05）。B2、B4相比，B4組Alistipes、Ruminiclostridium、Candidatus-Saccharimonas、Rikenella、Intestinimonas、Lachnoclostridium、Oscillibacter、Coprococcus、Faecalibaculum、Enterorhabdus、Peptococcus、Romboutsia、Papillibacter豐度上調(diào)（P＜0.05）；Lactobacillus、Bacteroides、Parasutterella、Escherichia、Erysipelatoclostridium、Parabacteroides、Candidatus-Stoquefichus豐度下調(diào)（P＜0.05）。B3、B4相比，B4組Helicobacter、Faecalibaculum豐度上調(diào)（P＜0.05）；Candidatus-Arthromitus豐度下調(diào)（P＜0.05）。

表3 四組小鼠樣本在屬水平的物種差異分析

為了更進(jìn)一步的分析各組間腸道菌群的組成及其各個物種的分布差異的大小，同時找出各組的優(yōu)勢菌群，采用了組間群落差異分析（多組間差異物種差異比較，LDA Effectt Size），該分析方法可實現(xiàn)多個分組之間的比較，并且能夠進(jìn)行分組內(nèi)部進(jìn)行亞組比較分析，從而找到各組樣本中發(fā)揮主要作用的菌屬以及組間在豐度上有顯著差異的物種（即Biomarker）。使用LEfSE軟件進(jìn)行LEfSE樹形圖繪制，見圖9。可以發(fā)現(xiàn)B1組中發(fā)揮主要作用且與其他組具有差異的是：Rikenellaceae、Uncultured-organism、Lactobacillaceae、Lactobacillales、Bacilli、Lachnospiraceae、Peptococcaceae、Clostridiales、Clostridia、Firmicutes。B2組中發(fā)揮主要作用且與其他組具有差異的是：Bacteroidaceae、Porphyromonadaceae、Enterococcaceae、Erysipelotrichaceae、Erysipelotrichales、Erysipelotrichia、Alcaligenaceae、Burkholderiales、Betaproteobacteria。B3組中發(fā)揮主要作用且與其他組具有差異的是：Coriobacteriaceae、Coriobacteriales、Coriobacterii、Bacteroidales、Bacteroidetes、Christensenellaceae、Desulfovibrionales、Desulfovibrionaceae。B4組中發(fā)揮主要作用且與其他組具有差異的是：Bifidobacteriaceae、Bifidobacteriales、Actinobacteria、Prevotellaceae、Cyanobacteria、Peptostreptococcaceae、Clostridiales、 Rhodospirillaceae、 Rhodospirillales、Alphaproteobacteria。

圖9 B組間腸道結(jié)構(gòu)存在的差異性

3 討論

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome，IBS)作為功能性腸病，內(nèi)臟髙敏感、胃腸道動力異常、食物不耐受和腸道菌群紊亂、精神心理異常、腸道感染、腦-腸軸功能異常、遺傳因素等多種因素參與IBS的發(fā)病[6]。目前，腸道微生態(tài)失衡是研究的一大熱點，也是目前治療胃腸道疾病的新靶點。

人體體表和體內(nèi)分布的共生微生物有80%生活在消化道內(nèi)，其種類超過1000種，重量可達(dá)2 kg，細(xì)胞總數(shù)超過1014個，約為人體自身細(xì)胞數(shù)量的1.3倍[7]。這些微生物的數(shù)量與基因總數(shù)如此龐大，必定會影響人體的身體健康狀況。腸道中的微生物可構(gòu)筑腸道生物屏障，幫助人體消化吸收，合成各種營養(yǎng)物質(zhì)及維持腸道免疫功能，從而維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡。當(dāng)腸道菌群發(fā)生紊亂，從而使這種平衡被打破，人體就可能患上各種疾病。

隨著當(dāng)代中醫(yī)藥工作者的深入研究，中醫(yī)中藥與微生態(tài)的本質(zhì)聯(lián)系將逐步被揭示出來，如中醫(yī)的整體觀、陰陽學(xué)說、天人相應(yīng)、正邪交爭、陰陽失調(diào)及臟腑學(xué)說等諸多方面均涵蓋著與腸道微生態(tài)學(xué)相關(guān)的內(nèi)容[8]。

健脾合劑是蘇州市中醫(yī)醫(yī)院的自制品種，名老中醫(yī)黃一峰的經(jīng)驗方，由四君子湯加味而成，主要藥物為黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、陳皮、山藥,具有健脾養(yǎng)胃，助運化滯的作用，適用于脾胃虛弱、胃納不香，臨床發(fā)現(xiàn)其治療IBS-D也有不錯的療效。黨參具有補脾肺氣、生津補血的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，黨參多糖和黨參皂苷能促進(jìn)腸道中益生菌屬的生長，抑制病原菌的定植，下調(diào)Firmicutes與Bacteroidetes比值（F/B），從而恢復(fù)了腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)[9]。白術(shù)具有健脾益氣的作用。葉清清等[10]研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)能顯著促進(jìn)嗜酸乳桿菌的增殖，并抑制大腸埃希菌的增殖。茯苓具有淡滲利濕、健脾寧心的功效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，茯苓對常見的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌等均有很好的抑制作用[11]。甘草具有補中益氣、緩急止痛、調(diào)和諸藥的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的甘草水提物可以下調(diào)擬桿菌門、變形菌門和脫硫弧菌的比例，上調(diào)厚壁菌門的比例[12]。陳皮以理氣為專長，兼有燥濕化痰，開胃消食的作用。現(xiàn)代研究表明，陳皮對胃腸道自發(fā)活動有一定的抑制作用，且能明顯拮抗組胺或乙酰膽堿引起的腸道的收縮痙攣，還具有一定的抗過敏作用，這些作用是陳皮理氣健脾、燥濕化痰的藥理學(xué)基礎(chǔ)之一[13]。山藥具有補脾養(yǎng)胃、益氣止瀉的作用。山藥多糖可以調(diào)節(jié)腸道菌群，長期灌胃山藥多糖可以抑制腸桿菌與腸球菌的菌群數(shù)量，促進(jìn)益生菌雙歧桿菌和乳桿菌的增殖[14]。綜上所述，健脾合劑具有益氣健脾、滲濕止瀉的作用，其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的作用相關(guān)。

通過不同分類學(xué)水平的菌群分析，查找健脾合劑和復(fù)合乳酸菌干預(yù)后脾虛型IBS-D小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)、多樣性的具體差異。實驗結(jié)果表明，通過稀釋曲線比較樣品的物種多樣性，發(fā)現(xiàn)造模后腸道菌群多樣性減少。Carroll等通過調(diào)查IBS-D患者的糞便和結(jié)腸黏膜，發(fā)現(xiàn)其微生物群落明顯和正常對照組不同，且糞便樣本中微生物多樣性明顯減少[15]，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致。王卓等[16]通過ERIC-PCR指紋圖譜作為脾虛證腸道菌群評價的分子指標(biāo)，研究四君子湯對番瀉葉和大黃致脾虛模型大鼠腸道菌群紊亂的影響；結(jié)果顯示番瀉葉和大黃造模后大鼠腸道菌群多樣性顯著下降，四君子湯干預(yù)后，大鼠腸道菌群的多樣性顯著提高。在本研究中，健脾合劑干預(yù)后小鼠腸道菌群多樣性恢復(fù)，該研究結(jié)果也與文獻(xiàn)報道一致。

在門水平上，研究發(fā)現(xiàn)：健脾合劑干預(yù)增加了Firmicutes、Bacteroidetes、Saccharibacteria、Tenericutes、Actinobacteria、Cyanobacteria、Verrucomicrobia的比例，減少了Proteobacteria、Deferribacteres的比例；而復(fù)合乳 酸 菌 增 加 了Bacteroidetes、Firmicutes、Saccharibacteria、Tenericutes、Actinobacteria、Cyanobacteria的比例，減少了Proteobacteria、Deferribacteres、Verrucomicrobia的比例。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)irmicutes與Bacteroidetes比值（F/B）升高會引起腸道免疫活性的改變，從而導(dǎo)致IBS-D的發(fā)生[17]，同時IBS患者糞便的F/B有所增加[18]。但在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)造模后14天的脾虛型IBS-D小鼠腸道中F/B比值較健康小鼠降低了0.39%，B3、B4兩組治療后F/B比值進(jìn)一步降低。Opdahl LJ等[19]指出，Saccharibacteria具有分解纖維素的作用；在本研究中，造模后小鼠腸道內(nèi)Saccharibacteria減少，健脾合劑和復(fù)合乳酸菌干預(yù)后促進(jìn)了該菌門的生長，考慮Saccharibacteria或能通過分解腸道內(nèi)纖維素使其被腸道吸收、利用從而減少排便次數(shù)來緩解疾病的癥狀。Actinobacteria能產(chǎn)生豐富的生物活性物質(zhì)，其代謝活性物質(zhì)具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒等活性，至今發(fā)現(xiàn)的天然抗生素中有三分之二是由放線菌產(chǎn)生，放線菌已被認(rèn)為是新抗生素產(chǎn)生的主要來源[20]。越來越多的證據(jù)表明，IBS是一種免疫-炎癥模式的胃腸道疾病，持續(xù)、低級別的炎癥反應(yīng)是該病的病理基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)，健脾合劑和復(fù)合乳酸菌均能夠通過增加放線菌門的占比，一方面調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，另一方面緩解了腸道的炎癥反應(yīng)。Jeffery IB等[21]指出，IBS-D患者腸道菌群中的Cyanobacteria比例增加。而在本實驗中造模后的脾虛型IBS-D小鼠腸道內(nèi)Cyanobacteria反而減少，藥物干預(yù)后Cyanobacteria增加，這與文獻(xiàn)報道不一致。張浩[22]研究發(fā)現(xiàn)，腹瀉羔羊糞便中Verrucomicrobia較健康羔羊而言豐度較高；結(jié)合實驗造模后小鼠腸道內(nèi)Verrucomicrobia豐度增加，復(fù)合乳酸菌干預(yù)后其豐度降低，該結(jié)果與文獻(xiàn)報道相一致；有報道稱，四君子湯治療脾虛證大鼠能夠降低其Verrucomicrobia的豐度[4]；而本研究中健脾合劑干預(yù)后Verrucomicrobia變化不明顯，這與文獻(xiàn)報道不一致。Proteobacteria是細(xì)菌中最大的一門，包括許多病原菌。研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群落的失衡通常源于Proteobacteria豐度的變化，同時腸道微生態(tài)失衡的過程中伴隨著變形菌門的增加[23]。在實驗中造模后，小鼠腸道中的Proteobacteria顯著增加，而藥物干預(yù)后抑制了該菌門的生長，說明脾虛型IBS-D小鼠的腸道菌群處于失衡狀態(tài)，藥物干預(yù)后使其恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。

在屬水平，健脾合劑干預(yù)后刺激了Alistipes、Ruminiclostridium、Candidatus-Saccharimonas、Rikenella、Intestinimonas、Lachnoclostridium、Oscillibacter、Coprococcus、Faecalibaculum、Enterorhabdus、Peptococcus、Romboutsia、Papillibacter的生長，抑制了Lactobacillus、Bacteroides、Parasutterella、Escherichia、Erysipelatoclostridium、Parabacteroides、Candidatus-Stoquefichus的生長。復(fù)合乳酸菌干預(yù)后刺激了Alistipes、Ruminiclostridium、Candidatus_Saccharimonas、Rikenella、Desulfovibrio、Intestinimonas、Roseburia、Lachnoclostridium、Oscillibacter、Blautia、Ruminococcus、Coprococcus、Faecalibaculum、Enterorhabdus、Parvibacter、Peptococcus、Syreptococcus、Papillibacter的 生 長 ；抑 制 了Lactobacillus、Bacteroides、Parasutterella、Escherichia、Erysipelatoclostridium、Akkermansia、Caproiciproducens、Parabacteroides、Candidatus-Stoquefichus的 生 長。Alistipes產(chǎn)生的磺胺脂（Sulfonamide，SLs）是一類不尋常的鞘脂，具有誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)或維持哺乳動物腸道中的細(xì)菌存活和應(yīng)激抗性作用[24]。免疫功能障礙是IBS的發(fā)病機(jī)制之一，我們推測Alistipes可能是通過影響腸道免疫功能而發(fā)揮作用。Huang Chunlan等[25]指出，急性壞死性胰腺炎大鼠腸道菌群中Candidatus-Saccharimonas減少，該菌屬的減少能夠加重腸屏障功能障礙并促進(jìn)TNF-α、IL-1β和IL-17A表達(dá)，導(dǎo)致胰腺和回腸末端更嚴(yán)重的組織病理學(xué)損傷；本研究中，造模后Candidatus-Saccharimonas比例降低，藥物干預(yù)后促進(jìn)了該菌的生長，我們推測Candidatus-Saccharimonas可能會通過抑制腸道炎癥因子的表達(dá)從而緩解脾虛型IBS-D的進(jìn)展。張亮等[26]報道，Desulfovibrio會破壞腸黏膜上皮細(xì)胞，損傷腸黏膜的屏障功能，參與IBS的腸道癥狀。但在本研究中，造模后小鼠腸道內(nèi)Desulfovibrio減少，復(fù)合乳酸菌干預(yù)后增加到與正常小鼠相似的水平，而健脾合劑對其無明顯影響。短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFAs）可被腸細(xì)胞直接利用，從而調(diào)節(jié)宿主的能量平衡、改善腸道通透性和內(nèi)穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)、代謝以及免疫細(xì)胞趨化性[27]，同時還具有抗炎、抗癌和抗菌活性[28]。Oscillibacter可以促進(jìn)SCFAs的產(chǎn)生[9]，且在本研究中B3、B4組該菌的豐度均明顯提高，考慮Oscillibacter可通過SCFAs對腸道的作用緩解小鼠腸道癥狀。有研究表明，Akkermansia定殖豐度過高的小鼠更容易導(dǎo)致過敏性腹瀉[29]。在本研究中，造模后的小鼠Akkermansia豐度提高，該結(jié)果與報道相一致。Lactobacillus是益生菌的重要組成部分，對宿主具有促進(jìn)消化、提升免疫力和抑制病原菌生長的益生特性[30]，但在本實驗中藥物干預(yù)后反而抑制了該菌的生長，這與文獻(xiàn)報道不一致。Parasutterella可能與IBS的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，也與IBS患者的慢性腸道炎癥有關(guān)[31]。造模后小鼠腸道中的Parasutterella明顯增加，藥物干預(yù)后抑制其生長，這與文獻(xiàn)報道相一致。Escherichia的代表菌是大腸桿菌，是與人類疾病密切相關(guān)的細(xì)菌，如菌血癥，尿路感染和腹瀉[32]。而腹瀉性大腸桿菌（DEC）菌株是腹瀉最常見的病原體之一，在本研究中B3、B4組該菌的豐度均明顯降低，可見通過抑制該菌的生長對改善脾虛型IBS-D的腹瀉癥狀有一定意義。

LEfSe分析進(jìn)一步說明健脾合劑和復(fù)合乳酸菌干預(yù)不同程度增加了脾虛型IBS-D小鼠中優(yōu)勢菌的多樣性。具體來看，本研究發(fā)現(xiàn)B2組小鼠腸道中優(yōu)勢菌僅限于Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria的9株菌，而B3組 則 是 分 屬 于Bacteroidetes、Firmicutes、Proteo-bacteria、Actinobacteria的8株菌；B4組中發(fā)揮關(guān)鍵作用的是屬于Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteria 的 10株菌。

在本研究中，B3、B4組與B1組之間小鼠腸道菌群均無明顯差異，說明健脾合劑和復(fù)合乳酸菌干預(yù)后均可調(diào)節(jié)腸道菌群使之達(dá)到或者接近正常的水平。健脾合劑和復(fù)合乳酸菌對脾虛型IBS-D小鼠腸道菌群的干預(yù)作用基本一致，在門水平均是通過調(diào)節(jié)優(yōu)勢菌門Actinobacteria、Tenericutes、saccharibacteria、Firmicutes、Cyanobacteria、Bacteroidetes的豐度，減少Proteobacteria、Deferribacteres的豐度，從而調(diào)節(jié)腸道菌群使之接近正常，且B3、B4組的優(yōu)勢菌門的差異性分析均無統(tǒng)計學(xué)意義；在屬水平，B3、B4組有顯著性差異的有Faecalibaculum、Helicobacter、Candidatus-Arthromitus。在本研究中，造模成功的小鼠腸道Helicobacter占比降低，健脾合劑干預(yù)可促進(jìn)了該菌的生長，使之接近健康小鼠的水平，說明健脾合劑可以從多方面調(diào)節(jié)腸道菌群使之接近或達(dá)到平衡狀態(tài)。

總之，健脾合劑對腸道菌群的干預(yù)作用可以歸結(jié)為兩方面：一方面，健脾合劑灌胃可以通過增加脾虛型IBS-D小鼠的腸道菌群多樣性、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的平衡，從而使其達(dá)到與健康小鼠相似的腸道菌群穩(wěn)態(tài)；另一方面，健脾合劑灌胃和復(fù)合乳酸菌灌胃后對脾虛型IBS-D小鼠腸道菌群的干預(yù)作用基本一致，推測健脾合劑可能有益生元樣作用。