黃芪建中湯抗疲勞機(jī)制研究＊

閆曙光，任 杰，潘亞磊，謝 培，周永學(xué)＊＊

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 咸陽 712046；2.陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心 咸陽 712046；3.陜西省胃腸病證方藥重點(diǎn)研究室 咸陽 712046）

疲勞是指人體腦力或體力勞動超負(fù)荷時，出現(xiàn)的以疲乏無力、精神不振為主要表現(xiàn)的生理現(xiàn)象，屬于亞健康狀態(tài)，長期疲勞狀態(tài)可導(dǎo)致機(jī)體免疫能力降低，引起條件致病菌的侵襲，同時疲勞也是多種疾病的常見并發(fā)癥，如糖尿病、慢性肝病、腎臟疾病等[1]。因此，緩解和消除疲勞，對預(yù)防疾病的發(fā)生和減少慢性疾病過程中的并發(fā)癥具有重要的意義，目前抗疲勞保健品的研發(fā)已經(jīng)逐漸被人們所重視。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采用運(yùn)動鍛煉、心理調(diào)適和營養(yǎng)膳食等方法預(yù)防和緩解疲勞[2]。中醫(yī)對疲勞的認(rèn)識既有完備的理論，又有大量藥食同源類藥物，而這些藥物被證實(shí)具有一定的抗疲勞作用，是抗疲勞中藥保健品研發(fā)的基石。中藥保健品是在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下，研制的具有保健作用，調(diào)理人體健康的食品[3]。復(fù)方是中醫(yī)藥治療疾病的主要方法之一，其中含有大量以藥食同源藥物組成的既有治病作用，又有保健作用的經(jīng)方，如桂枝湯類、建中湯類等。

從中醫(yī)角度講，疲勞屬于“虛勞”病，虛勞者，乃臟腑氣衰，氣血陰陽俱損也，論其治法，以補(bǔ)益氣血陰陽，恢復(fù)臟腑功能為主，然談及補(bǔ)益，又以“治脾”為第一要義，脾為后天之本，氣血陰陽皆從此出，因此脾胃功能失常則使氣血生化的源頭出現(xiàn)了異常，不能營養(yǎng)機(jī)體導(dǎo)致氣化功能衰敗，最終引發(fā)虛勞。治療虛勞以健運(yùn)脾胃為主，《千金》記載：“因積冷氣滯，或大病后不復(fù)常……名曰黃芪建中湯。”黃芪建中湯（HQJZT）有著健運(yùn)脾胃，促進(jìn)氣血陰陽化生的功效，是治療虛勞的經(jīng)典名方。本課題組前期研究結(jié)果表明，該方的基礎(chǔ)方小建中湯可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能而發(fā)揮抗疲勞的作用[4]。機(jī)體能量代謝功能降低是導(dǎo)致疲勞產(chǎn)生的重要機(jī)制之一[5]，黃芪建中湯是否可通過促進(jìn)機(jī)體能量代謝抗疲勞尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察該方對運(yùn)動后小鼠疲勞的耐受程度及能量代謝相關(guān)因子的影響，旨在為研制開發(fā)安全有效的調(diào)節(jié)能量代謝、抗疲勞保健品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物：清潔級km小鼠60只，雌雄各半，體重（20±4）g，購自西安交通大學(xué)動物中心，動物合格證號：SCX（陜）2012-003。動物飼養(yǎng)條件為SPF級［SYXK（陜）2017-004］。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)試劑：三磷酸腺苷含量試劑盒（批號：21080725）：購自蘇州科銘生物技術(shù)公司；糖原測試盒（批號：20180615）、血清尿素氮試劑盒（批號：20180713）、血乳酸測定盒（批號：20180527）、乳酸脫氫酶測定試劑盒（批號：20180612）、超氧化物歧化酶測定試劑盒（批號：20180816）：均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)儀器：ZB-200疲勞轉(zhuǎn)棒儀（成都泰盟軟件有限公司）；SCG-6水浴鍋（寧波新芝生物科技股份有限公司）；UV-2300紫外-可見光分光光度計(jì)（美國伯騰儀器有限公司）；SpectraMax5型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；CR22GII型高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）；電子天平（德國賽多利斯公司）；FB224分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；AF-10型自動制冰機(jī)（意大利SCOTSMAN公司）；T10勻漿機(jī)（德國IKA公司）。

1.4 黃芪建中湯藥液的制備

黃芪建中湯藥液的制備：黃芪建中湯藥物組成和劑量參考《方劑學(xué)》[6]教材，將全方藥物浸泡，2次煎煮，過濾，隨后放入飴糖于80℃恒溫水浴中，至飴糖融化，并分別濃縮成含生藥量0.154 g/mL、0.308 g/mL、0.616 g/mL藥液，避光4攝氏度冷藏備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物分組及給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為空白組、模型組、黃芪建中湯（HQJZT）高、中、低劑量組，每組10只，雌雄各半。空白組與模型組均給予蒸餾水0.5 mL/d灌胃，HQJZT高、中、低劑量組分別給予濃縮至0.616 g·mL-1、0.308 g·mL-1、0.154 g·mL-1（按照成人70 kg體重?fù)Q算劑量進(jìn)行含生藥量計(jì)算）的黃芪建中湯0.5 mL/d，連續(xù)給藥30 d。

2.2 疲勞耐受實(shí)驗(yàn)（疲勞動物模型建立）

人類疲勞的主要原因是由于長期過度的勞累所造成的，本實(shí)驗(yàn)通過疲勞轉(zhuǎn)棒儀采取強(qiáng)制性過度運(yùn)動的方式令動物模型符合人類疲勞狀態(tài)，此功能與跑步類似，通過強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)令小鼠達(dá)到疲勞狀態(tài)（如延長其運(yùn)動時間），當(dāng)實(shí)驗(yàn)小鼠達(dá)到疲勞狀態(tài)時，會從轉(zhuǎn)棒儀掉落，可繼續(xù)將其置于轉(zhuǎn)棒儀上，給予長時間運(yùn)動，使其達(dá)到不同的疲勞程度（本次研究在預(yù)試驗(yàn)階段，小鼠運(yùn)動時間達(dá)到1 h后，掉落次數(shù)增多，運(yùn)動狀態(tài)明顯減弱，1.5 h出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，后經(jīng)觀察解剖后，認(rèn)定其為過勞死，故以1 h為單位時間，觀察小鼠抗疲勞能力）。同時，通過給予相關(guān)藥物，還可觀察動物對疲勞的耐受程度（觀察運(yùn)動掉落時間和單位時間內(nèi)掉落次數(shù)），從而評價藥物的抗疲勞效果。給藥前，小鼠于轉(zhuǎn)棒儀（40 r/min）進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，隨后給藥，1 h后，除空白組外，其余各組小鼠置于轉(zhuǎn)棒儀（40 r/min）上進(jìn)行1 h疲勞運(yùn)動，記錄各組小鼠掉落次數(shù)。

2.3 標(biāo)本的收集與指標(biāo)的測定

小鼠疲勞耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，水合氯醛麻醉處理，腹主動脈取血，離心后取血清并對血清乳酸脫氫酶、乳酸、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、血清尿素氮含量進(jìn)行檢測；取小鼠肝臟和大腿內(nèi)側(cè)肌肉，以生理鹽水沖洗干凈，稱重，勻漿，檢測組織三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）和糖原含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 疲勞耐受能力

與模型組相比，HQJZT各組小鼠跑步轉(zhuǎn)棒時間明顯延長（P＜0.01），2 h內(nèi)掉落次數(shù)明顯減少（P＜0.01），且其劑量越大，跑步時間越長，掉落次數(shù)越少。運(yùn)動耐力是衡量機(jī)體抗疲勞能力的重要標(biāo)志，研究結(jié)果說明，黃芪建中湯能有效改善實(shí)驗(yàn)小鼠的運(yùn)動后疲勞，能夠提高運(yùn)動耐力，延長運(yùn)動時間。見表1。

表1 黃芪建中湯對小鼠跑步時間的影響（）

表1 黃芪建中湯對小鼠跑步時間的影響（）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

10 10 10 10組別模型組HQJZT高劑量組HQJZT中劑量組HQJZT低劑量組n 掉落次數(shù)28.11±3.06 11.50±2.67**15.00±3.21**18.86±4.18**轉(zhuǎn)棒時間（min）17.11±6.47 39.50±7.95**34.86±7.06**25.00±5.63**

表2 黃芪建中湯對疲勞后小鼠血清尿素氮和SOD的影響（）

表2 黃芪建中湯對疲勞后小鼠血清尿素氮和SOD的影響（）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組相比＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

SOD/（U/mL）256.21±15.73 176.09±16.25＃＃238.54±15.27**＃211.52±14.48**＃＃209.86±14.77**＃＃組別空白組模型組HQJZT高劑量組HQJZT中劑量組HQJZT低劑量組n 10 10 10 10 10血清尿素氮/(mmol/L)2.53±0.24 4.47±0.23＃＃2.90±0.22**＃3.63±0.27**＃＃3.77±0.26**＃＃

3.2 血清尿素氮和SOD

模型組血清尿素氮含量顯著高于空白組（P＜0.01），SOD活力明顯低于空白組（P＜0.01）；

HQJZT各組小鼠血清尿素氮含量顯著低于模型組（P＜0.01），血清SOD含量則顯著高于空白組和模型組（P＜0.01），其中高劑量組小鼠血清尿素氮含量高于空白組（P＜0.05），SOD含量低于空白組（P＜0.05），中、低劑量組小鼠血清尿素氮含量則顯著高于空白組（P＜0.01），SOD含量顯著低于空白組（P＜0.01）。機(jī)體的大量運(yùn)動后會產(chǎn)生眾多的代謝產(chǎn)物，尤其是在長時間運(yùn)動后，會逐漸消耗機(jī)體的蛋白，產(chǎn)生尿素氮、氧自由基等有害物質(zhì)，黃芪建中湯能促進(jìn)運(yùn)動后尿素氮的代謝，減少其在體內(nèi)的潴留，并且對體內(nèi)活性氧含量的提高與對體內(nèi)氧自由基的代謝皆有促進(jìn)作用。見表2。

3.3 肝臟和肌肉ATP含量

模型組小鼠肌肉和肝臟組織中ATP含量較空白組顯著降低（P＜0.01）；HQJZT各組ATP含量顯著高于模型組（P＜0.01），但仍低于空白組（P＜0.01）。ATP是生物體內(nèi)最直接的能量來源，運(yùn)動中會消耗大量的ATP，促進(jìn)ATP的及時恢復(fù)是抗疲勞的重要機(jī)制之一，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪建中湯能提高運(yùn)動后小鼠肌肉和肝臟組織內(nèi)的能量生成，促進(jìn)其運(yùn)動后疲勞的恢復(fù)。見表3。

表3 黃芪建中湯對疲勞后小鼠肌肉和肝臟中ATP含量的影響（）

表3 黃芪建中湯對疲勞后小鼠肌肉和肝臟中ATP含量的影響（）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組相比＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

10 10 10 10 10組別空白組模型組HQJZT高劑量組HQJZT中劑量組HQJZT低劑量組n 肝臟ATP 6.32±0.41 2.78±0.37＃＃4.97±0.28**＃＃4.59±0.30**＃＃3.28±0.29**＃＃肌肉ATP 5.32±0.34 2.10±0.23＃＃4.67±0.26**＃＃4.41±0.22**＃＃3.31±0.25**＃＃

表4 黃芪建中湯對疲勞后小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響（）

表4 黃芪建中湯對疲勞后小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響（）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組相比＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

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3.4 肝糖原和肌糖原含量

模型組小鼠肝糖原和肌糖原含量顯著低于空白組（P＜0.01）；HQJZT各組含量顯著高于模型組（P＜0.01），其中高劑量組含量與空白組無差異（P＞0.05），中、低劑量組仍低于空白組（P＜0.01）。糖原是組織能量的儲備形式之一，充足的糖原儲備為機(jī)體提供源源不斷的能量來源，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪建中湯能增加運(yùn)動后小鼠機(jī)體糖原儲備，從而增強(qiáng)其抗疲勞能力，究其原因可能是該方中含有大量糖類藥物。見表4。

3.5 血清乳酸脫氫酶和乳酸含量

與空白組比較，模型組小鼠血清乳酸脫氫酶含量顯著降低（P＜0.01），而血清乳酸含量則顯著升高（P＜0.01）；HQJZT各組小鼠血清乳酸脫氫酶含量皆高于模型組（P＜0.01），血清乳酸含量則顯著低于模型組（P＜0.01）；其中高劑量組小鼠血清乳酸脫氫酶和乳酸含量與空白組無差異（P＞0.05）；中、低劑量組血清乳酸脫氫酶仍低于空白組（P＜0.01），血清乳酸含量仍高于空白組（P＜0.01）。乳酸是機(jī)體無氧代謝的產(chǎn)物，是導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)肌肉酸痛、乏力的主要物質(zhì)，因此，促進(jìn)乳酸的及時代謝是使機(jī)體由疲勞恢復(fù)正常的必經(jīng)之路，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪建中湯通過促進(jìn)機(jī)體乳酸代謝繼而達(dá)到抗疲勞的作用，見表5。

表5 黃芪建中湯對疲勞后小鼠血清乳酸脫氫酶和乳酸含量的影響（）

表5 黃芪建中湯對疲勞后小鼠血清乳酸脫氫酶和乳酸含量的影響（）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組相比＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別空白組模型組HQJZT高劑量組HQJZT中劑量組HQJZT低劑量組n 10 10 10 10 10乳酸脫氫酶/（U/L）305.26±25.39 123.89±27.81＃＃284.84±23.18**248.16±22.04**＃＃229.66±31.91**＃＃乳酸/(mmol/L)1.13±0.14 2.55±0.18＃＃1.27±0.13**1.41±0.10**＃＃1.54±0.11**＃＃

4 討論

疲勞是人體自身生理機(jī)能水平下降或者臟腑維持機(jī)體運(yùn)轉(zhuǎn)能力降低，這是一種復(fù)雜的系統(tǒng)性生理改變，其產(chǎn)生與機(jī)體的能量代謝、代謝產(chǎn)物的堆積、內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)功能失常、免疫功能低下等相關(guān)[7-8]。疲勞最明顯的表現(xiàn)是機(jī)體運(yùn)動耐力水平降低[9]，本實(shí)驗(yàn)研究表明，黃芪建中湯能夠延長實(shí)驗(yàn)小鼠運(yùn)動時間，減少一定時段內(nèi)跌落次數(shù)，增強(qiáng)小鼠運(yùn)動能力，有明顯的抗運(yùn)動后疲勞的作用。機(jī)體未及時清除有害自由基將會導(dǎo)致代謝產(chǎn)物堆積引起疲勞發(fā)生，此時，一方面，自由基可對線粒體造成損傷，破壞膜完整性，使ATP酶活性降低，酶構(gòu)象發(fā)生變化，機(jī)體分解利用ATP減少；另一方面，破壞了電子漏的受控機(jī)制，使線粒體呼吸Ⅲ態(tài)呼吸時出現(xiàn)電子漏，致使合成ATP的效率降低[10]。SOD為機(jī)體清除氧自由基的重要酶，可直接反映機(jī)體的抗氧化水平[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度、長時間的運(yùn)動會過度消耗小鼠能量，肝臟和肌肉ATP含量明顯下降，氧自由基大量堆積導(dǎo)致血清SOD活力降低，而黃芪建中湯劑量越大越能有效升高血清SOD活力，提高ATP含量，調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝從而抗疲勞。

糖是能量的重要來源，運(yùn)動的機(jī)體會快速消耗肌肉及血液中的糖，此時肝臟的糖原會降解以維持血糖的穩(wěn)定。充足的肝糖原可有效維持運(yùn)動時的血糖水平，提供巨大能量，最終有效抗疲勞[12]。因此糖原也是評價抗疲勞能力的重要指標(biāo)之一。在機(jī)體激烈運(yùn)動的初期體內(nèi)的糖會通過無氧糖酵解途徑形成代謝終產(chǎn)物-乳酸。乳酸堆積是導(dǎo)致肌肉產(chǎn)生酸痛感進(jìn)而產(chǎn)生疲勞感主要原因，乳酸的消除有利于疲勞的恢復(fù)[13]。乳酸脫氫酶將乳酸還原成丙酮酸來反映機(jī)體抗疲勞能力[14]。隨著運(yùn)動時長的增加和強(qiáng)度的升高，蛋白開始參與能量代謝，蛋白代謝后會生產(chǎn)尿素氮[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度的運(yùn)動會減少疲勞小鼠體內(nèi)肝、肌糖原的儲備，并且隨著運(yùn)動時長的增加會逐漸消耗體內(nèi)的蛋白和乳酸乳酸脫氫酶，隨之造成代謝產(chǎn)物乳酸和尿素氮產(chǎn)量增加，而機(jī)體不能及時將其清除，產(chǎn)生肌肉疲勞和困倦感，因此小鼠運(yùn)動能力下降，掉落次數(shù)增多；而黃芪建中湯能增加實(shí)驗(yàn)小鼠肝、肌糖原的儲備，減少體內(nèi)蛋白質(zhì)和乳酸脫氫酶的消耗，從而減少乳酸和尿素氮的堆積，促進(jìn)乳酸的清除，既促進(jìn)了能量儲備，又減少了代謝產(chǎn)物堆積，且與劑量呈相關(guān)性。

綜上所述，黃芪建中湯具有抗疲勞作用，促進(jìn)機(jī)體的能量儲備和調(diào)節(jié)能量代謝，減少代謝產(chǎn)物的堆積可能是其抗疲勞的機(jī)制之一，但還需要進(jìn)一步研究。黃芪建中湯全方藥性平和，具有補(bǔ)益人體氣血陰陽，恢復(fù)脾胃功能的作用，方中藥物均無毒性，除芍藥外都可食，又具營養(yǎng)性，是日常生活中常用的食品，富含麥芽糖、蛋白質(zhì)、維生素、煙酸、環(huán)磷酸腺苷、氨基酸等人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)和黃酮、有機(jī)酸、桂皮醛，皂苷等具有抗氧化、促進(jìn)人體代謝功能的成分。同時，作為中藥又有其性味歸經(jīng)，具有一定的調(diào)理功能。因此，以該方基礎(chǔ)研發(fā)中醫(yī)藥類保健品既符合中醫(yī)藥的基本特色，又符合《保健食品管理辦法》對保健食品的要求。本研究結(jié)果為將建中類方劑轉(zhuǎn)化成有中醫(yī)藥特色的保健品提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。