Wnt5a基因與AECOPD患者中醫證型相關性研究＊

楊思情，周 進

（1.貴州中醫藥大學第一附屬醫院 貴陽 550002；2.秦皇島市中醫醫院 秦皇島 066000）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一種常見病、多發病，其以進行性發展的不可逆的氣流受限為主要特征；據世界衛生組織調查顯示COPD目前已成為世界第四大致死性疾病，據“全球疾病負擔研究項目（The Global Burden of Disease Study）”評估，到2020年，慢性阻塞性肺疾病將成為第三大致死性疾病[1]。2014年中國流調數據顯示目前該病的發病率為8.2%[2]，該病主要的病因有吸煙、職業粉塵、大氣污染、感染等。從病理上講，COPD以肺氣腫和慢性支氣管炎為主要病理特征[3]。在其病程發展過程中氣道重塑為其關鍵的病理改變；氣道平滑肌細胞和成纖維細胞可能參與其過程[4-5]，葛正行等[6,8]通過動物研究證實了Wnt/β-catenin信號途徑參與了氣道成纖維細胞的增殖過程。但是，尚未有研究報導Wnt5a基因與AECOPD患者中醫證型的關系，因此本研究希望通過檢測慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者外周血中Wnt5a基因表達量，并分析其與部分中醫證型的關系，為中醫證型診斷提供客觀依據。

1 資料及方法

表1 不同組別臨床基線資料比較

表2 肺脹證型診斷標準

1.1 實驗對象及分組

本研究的實驗對象為50例病例，按普通高等教育“十一五”規劃教材田德祿等主編的《中醫內科學》肺脹證型診斷標準，將患者分為痰濁壅肺證、痰熱郁肺證、肺腎氣虛、痰蒙神巧、陽虛水泛證共五組，其中痰濁壅肺證、痰熱郁肺證、肺腎氣虛三組各15例，痰蒙神巧2例，陽虛水泛3例，正常組15人，年齡40-90歲；因痰蒙神巧及陽虛水泛組病例數較少，沒有統計學意義，故目前本實驗僅討論痰濁壅肺證、痰熱郁肺證、肺腎氣虛三組及正常組。AECOPD患者肺功能分級中GOLD1 8例、GOLD2 15例、GOLD 3 17例、GOLD4 10例，其中痰濁壅肺證組GOLD1-4級病例數為3例、5例、5例、2例痰熱郁肺證組GOLD1-4級病例數分別為3例、6例、4例、2例，肺腎氣虛組GOLD1-4級病例數分別為2例、4例、6例、3例，痰蒙神巧GOLD1-4級病例數分別為0例、0例、1例、1例，陽虛水泛組GOLD1-4級病例數分別為0例、0例、1例、2例，見表1。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準

本研究參照《慢性阻塞性肺疾病全球防治倡議（GOLD）2017版》[1]及《慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)診治中國專家共識》（2017年更新版）[2]，擬定西醫診斷標準為：①既往明確診斷為COPD；②咳、痰、喘，呼吸困難加重，或者咯膿性痰液,并且需要調整原有治療方案方能控制病情；③除前述兩者外，其他引起上述臨床表現的疾病。

1.2.2 中醫診斷標準

按普通高等教育“十一五”規劃教材田德祿等主編的《中醫內科學》肺脹證型診斷標準，具體如表2。

1.3 納入標準

本研究納入標準：符合AECOPD西醫診斷標準；符合肺脹中醫證型診斷標準；自愿參與本實驗研究并簽署知情同意書；無其他系統嚴重疾病。

1.4 排除標準

本研究排除標準：合并心腦血管等系統疾病；近一月使用全身糖皮質激素治療者；合并有支氣管擴張、支氣管哮喘、肺間質疾病、肺結核、彌漫性支氣管炎等；合并各個系統腫瘤者；不能合作及不能完成肺功能檢查者。

1.5 中醫辨證質量控制

中醫辨證由貴陽中醫學院第一附屬醫院（國家級三級甲等中醫院）三名國家級名老中醫完成，使中醫證型更加準確。

2 實驗方法

2.1 標本采集、處置及總RNA提取

四組均空腹條件下抽取靜脈血液，將血液樣本置于離心機中以3000 r/min離心5分鐘。此時可見樣本分為三層：上層血清、中層有核細胞、下層紅細胞。取中間有核細胞層置于一新的去RNA酶1.5 mL EP管中，按1∶3（250μL樣本加入750μL TRIGene總RNA提取液）的體積量加入TRIGene總RNA提取液。

2.2 RNA完整性鑒定

采用瓊脂糖凝膠電泳法測定總RNA質量：稱取0.5 g瓊脂糖干粉置于三角燒杯中，加入1X TBE Buffer 5 mL，攪勻，置于微波爐中，中火加熱2分鐘，室溫冷卻至40℃-50℃后加入10μL GoldviewⅠ混勻。插好梳子后將其緩慢由一角倒入干凈電泳膠槽中，待其完全凝固后拔梳備用。吸取3μL總RNA液置于規格為0.2 mL的去酶EP管中，加入3μL 5 x loading buffer，充分混勻后吸出混合液加入點樣孔中，最后一排加入DNA marker以作比較。在電壓為120 mv，電流為80 mA環境下進行水平電泳15分鐘（負極到正極）。采用UVP系統，在312波長光下觀察并記入結果，選取總RNA質量好的樣品進行逆轉錄。

2.3 cDNA合成

將總RNA置于冰上解凍，并用DEPC-ddH2O配成終濃度為200 ng/μL的稀釋液。根據試劑盒提供的逆轉錄體系說明，將除總RNA外的試劑于冰上預混。具體如表3。

將預混液以16μL/管的劑量加入規格為0.2 mL去酶EP管中，并在每管中加入4μL濃度為200 ng/μL的總RNA稀釋液，構建20μL完整逆轉錄體系。將上述逆轉錄體系于普通PCR儀中進行逆轉錄，反應溫度設定為37℃逆轉錄15分鐘；85℃加熱5秒使逆轉錄酶失活；取出cDNA，加入60μL DEPC-ddH2O將產物稀釋4倍進行擴增。

2.4 Real-Time PCR擴增反應

2.4.1 引物設計與合成

引物設計與合成，根據基因庫設計并合成人βactin、Wnt5a，具體如表4。

2.4.2 RT-PCR擴增體系配置

RT-PCR擴增體系配置，采用SYBR Green分析法進行Real-Time PCR，擴增體系如表5。

2.4.3 RT-PCR反應程序設定

RT-PCR反應程序設定，將上述體系反應液加入八連管中，蓋緊蓋子，將其置于ABI 7500 PCR儀中采用兩步法擴增。反應終止后采用ABI 7500軟件分析相關數據。

表3 逆轉錄體系預混試劑表

表4 引物表

表5 Real-Time PCR擴增體系表

3 數據分析

采用統計軟件SPSS19.0進行數據統計學分析，采用均數±標準差（χˉ±s）表示，各組COPD急性加重期中醫證型之間符合正態分布采用采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩組間比較采用LSD法檢驗。不符合正態分布采用非參數檢驗，P＜0.05差異具有統計學意義，P＜0.01差異具有顯著統計學意義。

4 結果

4.1 各組間肺功能受損程度比較

肺功能GOLD1～4分級比較，痰濁壅肺組肺分別為3例、5例、5例、2例；痰熱郁肺組為3例、6例、4例、2例；肺腎氣虛組分別為2例、4例、6例、3例。各組換則會肺功能受損程度比較差異無統計學意義（Chi-SquareTest，χ2=1.336，P=0.97），見表6。

4.2 不同證型血液總RNA完整性檢測

各組血液總RNA在電泳后成像表現為三條光亮帶，其中明亮的28 s帶大約為18 s帶的兩倍，最前面的為5 s條帶，三條帶周圍未見其他雜帶及拖尾現象，說明提取的總RNA質量良好，無蛋白及DNA污染，無RNA降解

表6 各組患者在肺功能受損程度上的比較（Chi-Square Test）

圖1 各組血液總RNA在電泳后成像

圖2 Wnt5a基因熔解曲線

圖3 Wnt5a基因擴增曲線

4.3 Wnt5a基因擴增曲線圖

各指標中沒有引物二聚體以及非特異性擴增高峰的出現，說明引物設計合理，特異性較高。

4.4 Wnt5a基因的mRNA在不同中醫證型中相對表達量情況

圖4 β-actin基因熔解曲線

圖5 β-actin基因擴增曲線

表7 Wnt5a基因的mRNA相對表達量（）

表7 Wnt5a基因的mRNA相對表達量（）

組別正常組痰濁壅肺痰熱郁肺肺腎氣虛例數15 15 15 15 Wnt5a基因表達量（2-ΔΔct）1±0.05 1.45±0.54 1.70±0.71 2.11±0.92

圖6 各種證型Wnt5a基因的表達量

如表7、圖6所示，正常組基因表達量為1±0.05、痰濁壅肺組表達量為1.45±0.54、痰熱郁肺組為1.70±0.71、肺腎氣虛組表達量為2.11±0.92，可見隨著病情的家中，Wnt5a基因的mRNA也隨之升高。與正常組相比，痰濁壅肺組、痰熱郁肺組、肺腎氣虛組中Wnt5a基因的表達量明顯增高（P＜0.01）；組間比較：三組之間存在明顯差異，且表達量：痰濁壅肺＜痰熱郁肺＜肺腎氣虛（P＜0.01）。

4.5 Wnt5a基因與AECOPD中醫證型相關系數情況

運用線性回歸Kendall相關系數和Spearman相關系數分析，Wnt5a基因的mRNA相對表達量與AECOPD中醫證型相關性研究（Kendall相關系數r=0.779和Spearman相關系數r=0.856，P=0.000＜0.01），具有顯著統計學意義，表明Wnt5a基因mRNA相對表達量與AECOPD中醫證型之間存在直線線性相關關系，且呈正性相關。見表8。

5 討論

COPD是一種氣流受限不完全可逆呈進行性發展的可以預防和治療的疾病，氣道重建是COPD病理進展的關鍵[9-10]。葛正行教授等[11]研究發現，Wnt信號通路在COPD大鼠及患者氣道重塑的過程中起到重要作用。Wnt5a信號通路是Wnt信號通路中的非經典通路[12]，激活該通道的關鍵蛋白主要有Wnt11等。有研究證明，在肺間質纖維化疾病中Wnt5a參與其纖維化過程[13-15]；哮喘大鼠肺組織中Wnt5a增高并與TGF-β1呈正相關關系[16]，提示其可能影響氣道纖維化而促進氣道重塑，袁霞等[17]發現COPD模型大鼠肺成纖維細胞中Wnt5a表達量增高，提示其可能通過促進成纖維細胞增生參與氣道重塑。本研究通過檢測AECOPD患者外周血中Wnt5a基因及蛋白表達量，發現與正常組相比其他組表達量明顯較低，這提示Wnt5a信號通路可能在COPD氣道重塑過程中扮演著重要角色。

AECOP在中醫歸屬于“喘證”或者“肺脹病”范疇，其主要臨床特征為咳、痰、喘、悶、滿。中醫將其分為痰濁壅肺、痰熱郁肺、痰蒙神竅、肺腎氣虛、陽虛水泛五個證型，現代中醫學者多從痰、瘀、虛、氣滯等方面對其進行辨證論治，本次研究發現，AECOPD患者中痰濁壅肺、痰熱郁肺、肺腎氣虛三個證型Wnt5a基因mRNA的表達量均高于正常組，三組之間比較，P＜0.01，差異具有顯著統計學意義，且肺腎氣虛組與痰濁壅肺證和痰熱郁肺證組分別比較，P均＜0.01。AECOPD患者發病早期病理性質多為本虛標實，日久疾病反復遷延不愈，正氣虛損。本次研究發現，隨著患者病情的加重，Wnt5a基因mRNA的表達量也逐漸增加，且通過線性回歸Kendall相關系數和Spearman相關系數分析后發現（Kendall相關系數r=0.779和Spearman相關系數r=0.856，P=0.000＜0.01），具有顯著統計學意義，表明Wnt5a基因mRNA相對表達量與AECOPD中醫證型之間存在直線線性相關關系，且呈正性相關。提示Wnt5a基因的表達量可以隨病人病程的延長及病情的加重其活化的程度也越來越高。

表8 三種證型的Wnt5a

基于上述論述，本研究猜想Wnt5a基因在患者血液中的表達可以作為中醫診斷AECOPD證型的客觀指標之一，但是本研究由于痰蒙神竅及陽虛水泛組病人較少，故未能完整地探討該基因與完整中醫證型的關系。