氣不攝血證免疫性血小板減少癥患者血管活性物質及相關炎癥因子變化與臨床意義＊

王洪志，朱世榮，2，胡曉梅＊＊，王明鏡，3，諶海燕，全日城，丁曉慶，趙 攀，3，范 騰，3，李雨蒙，2，郭小青，姜云耀

（1.中國中醫科學院西苑醫院 北京 100091；2.北京中醫藥大學 北京 100029；3.中國中醫科學院研究生院 北京 100700；4.北京中醫藥大學東方醫院 北京 100078）

免疫性血小板減少癥是常見的免疫介導的出血性疾病，以骨髓中巨核細胞成熟障礙，外周血小板計數減少為特點，多有皮膚黏膜、內臟甚至腦出血等表現。中醫學多以出血為切入點，基于氣血相關理論，從氣血失衡，血溢脈外認識該病，將本病歸為“血證”、“發斑”、“紫癜”等范疇，氣不攝血證是ITP常見證型[1]?，F代醫學主要是從免疫失衡、血管功能障礙等方面認識該病。血管內皮素（ET-1）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶、血管內皮生長因子（VEGF）等是維持血管內皮功能與受損修復的重要血管活性物質[2-3]，而一些炎癥因子對血管功能亦具有直接或間接調節作用[4-5]。本研究從血管活性物質及相關炎癥因子入手，探討氣不攝血證ITP患者血管內皮功能變化及其意義。

1 材料與方法

1.1 診斷標準

西醫ITP診斷標準：參照《成人原發免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識（2016年版）》[6]。

中醫氣不攝血證ITP證候診斷標準：參照國家中醫藥管理局2010年中醫血液病重點專科紫癜病（免疫性血小板減少癥）中醫診療方案[7]。

1.2 納入標準

本研究納入標準：①符合西醫免疫性血小板減少癥診斷標準及中醫氣不攝血證紫癜病診斷標準；②年齡在18～75歲之間；③自愿簽署知情同意書。

1.3 ITP出血分組標準

參照《成人原發免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識（2016年版）》[2]將ITP患者依據出血程度分為未出血組、低危組（≤2分）及高危組（＞2分）。

1.4 排除標準

本研究排除標準：①嚴重消化道和（或）臟器出血；②合并嚴重心、肝、腎等臟器功能不全者；③精神病患者；④過敏體質、妊娠或哺乳期婦女；⑤正在參加其他臨床研究者。

1.5 一般資料

篩選2016年12月至2017年6月期間中國中醫科學院西苑醫院及北京中醫藥大學東方醫院就診，且符合氣不攝血證ITP患者30例（試驗組）。其中，男性12例、女性18例，年齡18～65歲，中位年齡為46歲，血小板計數(19.25～44.75)×109/L。22例患者有出血癥狀，根據2016版ITP出血評分量表，將30例ITP患者分為未出血患者8例、低?；颊?4例及高危患者8例。凝血酶原時間（11.5～13秒）、活化部分凝血活酶時間（21.9～32.8秒）、凝血酶時間（15～17.2秒）以及纖維蛋白濃度（2.43～3.68 g/L）均在正常范圍。對照組20例為我院健康志愿者（對照組），男性8例，女性12例，年齡21～55歲，中位年齡45歲，血小板計數122～230×109/L。對照組與試驗組在年齡、性別相比均無顯著差異（P＞0.05）。

本研究獲得中國中醫科學院西苑醫院臨床研究倫理委員會批準（2015XLA108-2），并在中國臨床試驗注冊中心注冊（ChiCTR-IOR-17014236）。

1.6 主要實驗試劑及儀器

NO/NOS、ET-1試劑盒由北京洛奇檢驗所有限公司提供。（NO試劑盒：A012-1-2，NOS試劑盒：A014-2-2,南京建成生物工程研究所；ET-1試劑盒：QETOOB，R&D systems,Inc）。細胞因子IL-8、IL-10、IL-17A、TNF-α、VEGF-A、VEGF-D試劑盒由北京曠博生物有限責任公司提供。Aimplex?Human custom 15-plex kit（T1C156701北京曠博生物技術股份有限公司）；Aimplex?TGFbeta1 1-plex kit（B111206北京曠博生物技術股份有限公司）；MS3數顯型振蕩器（3319000德國IKA公司）；高速冷凍離心機（GL-16G瑞江分析儀器有限公司）；渦旋器（QL-902其林貝爾儀器制造有限公司）；Aimplex?EZPrep洗板儀（VM1001北京曠博生物技術股份有限公司）；流式細胞儀（NovoCyte D1040艾森生物有限公司）。

1.7 實驗方法

抽取外周血5 mL，混勻后全血離心(3000 r/min，4℃l0 min)，分離血漿。細胞因子IL-8、IL-10、IL-17A、TNF-α、VEGF-A及VEGF-D檢測按照AimPlex測試說明書進行，酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測周血中NO、NOS以及ET-1，具體操作按照說明進行。

1.8 統計學方法

本研究采用SPSS22.0統計軟件處理數據，實驗結果以均數±標準差()表示。氣不攝血證ITP組與對照組的比較采用獨立樣本T檢驗，多組之間的比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氣不攝血證ITP患者血管活性物質NO、NOS、ET-1、VEGF-A、VEGF-D的變化

為了解氣不攝血證ITP組患者血管活性物質NO、NOS、ET-1、VEGF-A及VEGF-D的含量，本研究應用ELISA法測定了NO、NOS、ET-1含量，AimPlex流式高通量多細胞因子檢測技術檢測了血清VEGF-A及VEGF-D含量。結果顯示，與對照組相比較，氣不攝血證ITP組NOS、VEFG-A含量顯著降低（P＜0.05），ET-1含量顯著增高（P＜0.05），NO、VEGF-D含量未見顯著差異（P＞0.05），見表1。

2.2 氣不攝血證ITP患者血管相關性炎癥因子IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α的變化

為了解氣不攝血證ITP血管相關炎癥因子IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α含量，本研究應用AimPlex流式高通量多細胞因子檢測技術檢測了血清IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α含量。結果顯示，與對照組相比較，氣不攝血證ITP組患者IL-10含量顯著降低（P＜0.05），而IL-8、IL-17A及TNF-α含量顯著增高（P＜0.05）。見表2、圖1。

2.3 氣不攝血證ITP未出血、低、高危出血患者血管活性物質NO、NOS、ET-1、VEGF-A及VEGF-D的變化

為了解氣不攝血證ITP患者出血程度與NO、NOS、ET-1、VEGF-A及VEGF-D含量的關系，本研究比較分析了未出血組、低高危出血組患者上述指標的變化。結果顯示，高危組患者ET-1含量顯著高于未出血患者（P＜0.05），其余血管活性物質含量在三組患者中未見顯著差異（P＞0.05），見表3。

表1 氣不攝血證ITP組與對照組NO、NOS、ET-1、VEGF-A、VEGF-D含量

表1 氣不攝血證ITP組與對照組NO、NOS、ET-1、VEGF-A、VEGF-D含量

注：*：與對照組相比，P＜0.05

VEGF-D/(pg·mL-1)6.83±1.11 6.18±2.24分組對照組ITP組n 20 30 NO/(μmol·L-1)65.49±20.41 61.33±19.46 NOS/(u·mL-1)26.30±01.47 21.32±1.51*ET-1/(pg·mL-1)0.95±0.66 1.02±0.82*VEGF-A/(pg·mL-1)31.12±7.37 12.94±5.92*

表2 氣不攝血證ITP組與對照組IL-10、IL-8、IL-17A以及TNF-α含量

表2 氣不攝血證ITP組與對照組IL-10、IL-8、IL-17A以及TNF-α含量

注：*：與對照組相比，P＜0.05

TNF-α/(pg·mL-1)2.49±0.41 3.95±2.70*分組對照組ITP組n 20 30 IL-10/(pg·mL-1)5.19±0.51 3.57±0.67*IL-8/(pg·mL-1)23.48±6.15 778.01±143.84*IL-17A/(pg·mL-1)147.97±19.66 217.70±33.08*

表3 氣不攝血證ITP患者三組NO、NOS、ET-1、VEGF-A、VEGF-D含量

表3 氣不攝血證ITP患者三組NO、NOS、ET-1、VEGF-A、VEGF-D含量

注：*：與對照組相比，P＜0.05

VEGF-D/(pg·mL-1)6.34±1.94 6.95±1.18 6.16±2.24分組未出血組低危出血組高危出血組n 8 1 4 8 NO/(μmol·L-1)60.55±17.11 60.20±15.04 63.92±15.49 NOS/(u·mL-1)20.89±2.04 21.37±0.88 21.01±2.05 ET-1/(pg·mL-1)0.97±0.09 0.99±0.06 1.18±0.42*VEGF-A/(pg·mL-1)12.81±3.11 13.46±1.75 13.08±4.54

圖1 應用AimPlex流式高通量技術檢測IL-10，IL-8，IL-17A以及TNF-α表達

2.4 氣不攝血證ITP患者出血與NO、NOS、ET-1、VEGF-A、VEGF-D之間的回歸分析

為進一步了解氣不攝血證ITP患者出血與上述指標的關系，本研究將氣不攝血證ITP患者分為出血組及未出血組，并分析出血與上述指標的關系。結果顯示，氣不攝血證ITP患者出血與ET-1及VEGF-A含量相關(P＜0.05)，但與NO、NOS及VEGF-D含量未見顯著相關性（P＞0.05），見表4。

2.5 氣不攝血證ITP未出血、低高危出血患者血管相關性炎癥因子IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α的變化

為了解氣不攝血證ITP患者出血程度與IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α含量的關系，本研究比較分析了未出血組、低、高危出血組患者上述指標的變化，結果顯示，三組患者在IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α表達上未見顯著差異（P＞0.05），見表5。

表4 氣不攝血證ITP患者出血與NO、NOS、ET-1、VEGF-A、VEGF-D含量回歸分析

2.6 氣不攝血證ITP患者出血與IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α之間的回歸分析

為進一步了解氣不攝血證ITP患者出血上述指標的關系，本研究將氣不攝血證ITP患者分為出血組及未出血組，并分析出血與上述指標的關系。研究結果顯示，氣不攝血證ITP患者出血與上述炎癥因子含量未見顯著相關性（P＞0.05），見表6。

3 討論

免疫性血小板減少癥，是臨床上常見的由細胞免疫、體液免疫介導的獲得性出血性疾病。隨血小板減低程度加大，其出血風險逐漸增加[8-9]。臨床上，我們發現有些患者血小板計數在安全范圍卻有很明顯的出血傾向，而一些患者血小板計數很低但出血傾向不明顯。本研究推測ITP患者出血除了與血小板計數有關外，可能與血管內皮功能有關。本研究從主要血管活性物質及相關炎癥因子入手，應用2016版ITP出血評分量表對ITP患者出血程度進行劃分，初步探討氣不攝血證ITP患者主要血管活性物質、炎癥因子變化對出血的影響。

血管活性物質在保持血管的正常狀態和功能中發揮重要作用[10]。NO是已知最強的血管舒張因子，由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化氧化還原反應生成的，具有一定的松弛血管及抑制血小板的活化的作用[11]。ET-1是已知最強的縮血管活性短肽，可激活血漿中的單核細胞，促使其產生炎性因子，而炎性因子分泌水平的上調又會導致ET-1水平升高，形成惡性循環，損害血管內皮細胞[12-13]。若ET及NO表達異常，則血管舒縮功能失衡，造成血管內皮功能紊亂，進而導致血管壁完整結構破壞引發出血[14]。VEGF-A是促進血管生成的重要因子，當血管受損時，機體會產生大量VEGF-A，通過增加血管通透性加快內皮細胞遷移對受損的組織進行修復[15-16]。VEGF-D主要通過與內皮細胞上的VEGFR-2、VEGFR-3的結合并使之激活，產生脈管系統的增生[17]。

本研究結果表明，與正常對照組相比較，氣不攝血證ITP患者ET-1表達顯著增高（P＜0.05），NOS表達顯著下降（P＜0.05），但NO表達未見明顯差異（P＞0.05）?？赡苁且驗镋T-1的高表達使血管收縮，加劇了血管缺血缺氧，從而抑制內皮型NOS(eNOS)活性，進而降低體內NOS水平，減少NO產生，使NO/ET軸紊亂，導致血管舒縮功能障礙，加重了ITP患者出血[10,18]。同時發現，高危出血組患者ET-1表達水平顯著高于未出血患者（P＜0.05），氣不攝血證ITP患者出血與ET-1表達相關，這揭示了ET-1的高表達對血管內皮潛在的損害作用。同時，與對照組相比，VEGF-A表達顯著降低（P＜0.05），VEGF-D表達未見顯著差異（P＞0.05），氣不攝血證ITP患者出血與VEGF-A表達相關，這提示VEGF-A參與到ITP血管內皮損傷的進程中，但如何發揮作用尚需研究。

除血管活性物質外，部分炎癥因子與血管活性物質密切相關，可損傷血管內皮，引起出血[4-5]，如NO促進Th2亞型可釋放產生IL-10[19-20],而IL-17A可直接促進VEGF表達[21-24]。TNF-α既促進NOS、ET-1及VEGF表達，同時，ET-1升高亦能促進IL-8、TNF-α等炎性介質釋放，啟動并放大炎癥反應[21-26]。另有文獻報道，大量TNF-α的產生與釋放會破壞機體免疫平衡，造成血管功能異常[27-28]；IL-17A促進炎性和粘附分子釋放，從引起機體的組織炎性細胞浸潤，加劇血管損傷[29-30]。

表5 氣不攝血證ITP患者三組細胞因子IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α含量

表6 氣不攝血證ITP患者出血與IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α含量回歸分析

結果顯示，正常對照組相比較，氣不攝血證ITP患者IL-10表達水平顯著下降（P＜0.05），而TNF-α、IL-8、IL-17A表達顯著增高（P＜0.05）。高表達的TNF-α可以下調NOS的表達，這也解釋了NOS低表達的原因。同時，由血管相關炎癥因子可以看出，氣不攝血證ITP患者存在多種炎癥因子如TNF-α、IL-8、IL-17A的高表達，IL-10抑炎相關因子低表達，促炎與抑炎表達失衡進一步加劇血管損傷，導致出血。

ITP病證中氣虛到氣不攝血、血溢脈外是一個由輕到重的連續性變化過程，其病機過程體現著“氣為血帥，血為氣母”的氣血相關病證理論。臨床上氣不攝血是ITP常見證型，益氣攝血是臨床治療ITP常用的治法[1]。氣不攝血證ITP患者存在ET軸及NO系統信號通路功能紊亂以及血管內皮表達異常，上述研究表明，通過益氣攝血法來調節ET軸及NO系統信號通路，可能是臨床治療氣不攝血證ITP的一個重要途徑。