早期應用黃連解毒湯對多發性腦梗死動物模型認知功能及Notch 信號通道的影響

姜海偉 ，笱玉蘭，邵 衛，陳國華*，羅利俊，王俊力,，高 炎

（1.湖北中醫藥大學，武漢 430065；2.武漢市中西醫結合醫院，武漢 430022）

卒中后認知障礙是目前卒中診療的研究熱點之一。王永炎院士提出中風“毒損腦絡”的學術觀點[1]，同時認為“毒損腦絡”是卒中后癡呆的重要致病病機[2]。從卒中發生到卒中后認知障礙出現，“毒”邪的產生一般在中風發生前或發生時已經出現，盡早干預“毒邪”對防治卒中后認知障礙有重要的意義。本研究通過實驗方法，以黃連解毒湯為解毒代表方，采用造模后24 h 和造模后7 d 的不同時段給藥，觀察其對實驗大鼠行為學、大腦皮層Notch 信號通路的影響，綜合評價不同時段給藥對大鼠行為學的影響及作用機制，進而明確早期采用黃連解毒湯干預能否減少卒中后認知障礙的發生，同時了解解毒治療的應用時機問題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 采用SPF 級SD 大鼠60 只，體質量（250±30）g，購買于湖北省宜昌大學醫學院動物中心。SYXK（鄂）2017-0067。溫度：21～25 ℃，日溫差：±1 ℃，濕度：50%～70%，普通飼料喂養。蘇木素染液，伊紅染液由谷歌生物提供。EDTA（pH 值8.0）抗原修復液、G1206、EDTA（pH 值9.0）抗原修復液、檸檬酸（pH 值6.0）抗原修復液由Servicebio 提供。Notch1 多克隆抗體、Hes1 多克隆抗體、VEGF 多克隆抗體、Stat3 多克隆抗體由Servicebio 提供。脫水機、包埋機，武漢俊杰電子有限公司。病理切片機，上海徠卡儀器有限公司提供，掌上離心機由Servicebio提供，成像系統，由日本Nikon 提供。酶標檢測儀，由Rayto 提供。Morris 水迷宮視頻檢測儀由湖北中醫藥大學中醫藥實驗室提供。黃連解毒湯：由黃連、黃芩、黃柏、梔子按 3:2:2:3 比例混合，加10 倍量水，煎煮1 h，共煎3 次。濾液合并，離心后濃縮干燥即得，收率為 20%（含黃芩苷 58.39 mg/g，HPLC 測定）。其提取物由武漢市中西醫結合醫院制劑中心提供,課題組采用 HPLC 法測定黃連解毒湯提取物中黃芩苷含量的方法作為質控標準。

1.3 動物造模方法 采用多發性腦梗死動物模型[3]。血栓制備：同種SD 大鼠經頸動脈采血，干燥研碎，制成血栓栓子，按1 mg 栓子加0.9%氯化鈉注射液0.3 mL 比例，搖勻制備血栓懸液。造模：取10%水合氯醛腹腔麻醉，頸部正中切開皮膚，分離肌肉筋膜等組織，可看到頸總動脈、頸外動脈與頸內動脈，取止血夾暫時夾閉頸總動脈，取1 mL注射器吸入血栓懸液，于頸外動脈逆行注入血栓懸液0.3 mL，推注同時謹慎開放頸總動脈，使血栓可通過頸內動脈的血流進入顱內各動脈，從而造成多發性腦梗死，然后結扎頸外動脈注射口近端及遠端,縫合皮膚。術后每鼠肌肉注射青霉素10 萬U，連續注射4 d。假手術組于頸部正中切開皮膚后，僅分離出頸總動脈后，不結扎、不剪斷，暴露5 min 直接縫合皮膚。造模成功評估：使用mNSS評分表對大鼠進行綜合評定，內容包括肌力、意識、肌張力、感覺、反射、共濟運動。評分大于2 分以上為造模成功。造模結果：根據神經功能評分結果及存活情況，最后入選情況為：假手術組11 只，7 d 模型對照組10只，24 h模型對照組11只，7 d黃連解毒湯10只，24 h 黃連解毒湯11 只。其中假手術對照組不予以處理；24 h 模型對照組及7 d 模型對照組，在造模成功后24 h及7 d 給予等量溶劑，0.5% 羧甲基纖維素鈉溶液 1 mL/（100 g·d），連續給藥 1 個月；24 h 及7 d 黃連解毒湯組，在造模成功后24 h 及7 d 予以中劑量黃連解毒湯433 mg/（kg·d）灌胃[4]。

1.5 大鼠腦組織取材 按照實驗安排，給藥 28 d 并完成水迷宮實驗后，從每組動物中各隨機選取4只大鼠，麻醉后將其固定、開胸，將灌注針頭從大鼠心尖部進針，經左心室插入升主動脈，剪開右心耳，緩慢注入肝素化生理鹽水約200 mL，可見右心耳處流出清澈液體，再灌注4%多聚甲醛約250 mL，灌注期間可見大鼠四肢抽搐，暴露的肝臟組織逐漸變硬變白，待抽搐停止時停止灌注，斷頭后將整塊腦組織翹起，取出后剝離硬腦膜，將腦組織置于4%多聚甲醛固定[5]。其余大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.35 mL/100 g），于枕骨大孔處用剪刀橫斷，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀，剪開頂骨，用止血鉗分離兩邊頂骨，剪斷視神經后用剪刀探到顱底，將整塊腦組織翹起。將腦組織置于冰塊上，于5 min 內謹慎分離出大腦皮層組織和海馬組織。分離后于液氮中迅速冷凍，取出后置于-80℃冰箱保存[6]。

1.4 指標檢測及方法

1.4.1 實驗大鼠行為學檢測 Morris 水迷宮實驗[7]各組大鼠喂藥28 d 后進行。Morris 水迷宮主要包括定位航行實驗：先連續訓練4 d，大鼠在120 s 內爬上隱蔽平臺，并停留3 s 以上，此為逃避潛伏期。如果120 s未能找到平臺，將其引導到平臺，熟悉10 s后撤離大鼠。第5 天，從平臺所在象限對角象限作為入水點，作為最后的游泳結果，電腦軟件可記錄逃避潛伏期時間和運行軌跡。空間探索實驗：同樣在實驗第5 天，撤去水中的隱蔽平臺，取原平臺的對角象限作為入水點，將大鼠放入水中游泳，電腦軟件可觀察并記錄120 s 內大鼠穿過原平臺區域的次數。

1.4.2 HE 染色檢測大鼠腦皮質梗死區及梗死周圍區細胞顯微結構 隨機將組織從4%多聚甲醛固定液取出進行脫水。將浸好蠟的組織于包埋機內進行包埋并貼上對應的標簽。冷卻后切片，脫蠟，伊紅染液中染色1～3 min。再進行乙醇脫水封片，從二甲苯取出切片晾干，采用中性樹膠封片[8]。顯微鏡下觀察分析。

1.4.3 Western blot 檢測大鼠皮質中 Notch 信號通道Notch1 和 Hes1 蛋白及Stat3 蛋白、血管內皮生長因子VEGF蛋白含量 大鼠新鮮腦組織取梗死側大腦皮層，充分裂解，用BCA 試劑盒進行蛋白定量并計算上樣量，行蛋白SDS-PAGE 電泳，轉膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），將 Notch1、Hes1 以及Stat3、VEGF、β-actin一抗用抗體稀釋液稀釋后進行膜孵育，置于條件為4 ℃的搖床中過夜。第二天用TBST 液洗滌3 次，加入稀釋過生物辣根過氧化酶 H R P 標記的二抗，室溫下孵育 2 h，隨后用 ECL 液進行顯影，并用Image（美國BIO-R AD 公司）的圖像處理軟件進行處理，測定各樣本灰度值[10]。

1.6 統計學方法 使用 SPSS 19.0 統計分析軟件進行數據的統計學分析。實驗數據均采用均數 ± 標準差（）表 示，各組之間的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學檢測結果

2.1.1 定位航行實驗結果 見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期測定結果（） s

表1 各組大鼠逃避潛伏期測定結果（） s

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與7 d 模型對照組比較，△P＜0.05；與7 d 黃連解毒湯比較，▲P ＜0.05；與24 h 模型對照組比較，□P ＜0.05

2.1.2 空間探索實驗結果 見表2。

表2 各組大鼠120 s 內通過平臺次數（）

表2 各組大鼠120 s 內通過平臺次數（）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與7 d 模型對照組比較，△P＜0.05；與7 d 黃連解毒湯比較，▲P ＜0.05，與24 h 模型對照組比較，□P ＜0.05

2.2 各組大鼠HE 染色病理結果 各模型組皮質梗死區腦細胞增大，結構欠清，細胞核偏居一側，部分神經元出現死亡。梗死周圍區細胞大小居中，細胞核居中飽滿，24 h 黃連解毒湯組可見梗死區細胞核縮小，存活細胞密度高，胞漿著色與梗死周圍區其他模型組相比相對差異較小，其余各模型組差異不明顯。假手術組未見明顯梗死區域及梗死細胞。見圖1。

圖1 各組大鼠梗死區及梗死周圍區HE 染色病理結果

2.3 對各組大鼠皮層中 Notch1、Hes1、Stat3、VEGF蛋白的影響 7 d 及24 h 模型對照組大鼠腦組織皮層中 Notch1、Hes1、Stat3 蛋白表達高于假手術組（P＜0.05）；7 d 及24 h 黃連解毒湯組與假手術、7 d及24 h 對照模型組比較，Notch1、Hes1、Stat3 蛋白表達顯著下降（P＜0.05）。24 h 黃連解毒湯組和7 d 黃連解毒湯組對比，Hes1 蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠皮層中 Notch1、Hes1、Stat3、VEGF 蛋白表達情況

圖4 各組大鼠皮層中 Notch1、Hes1、Stat3、VEGF 蛋白表達灰度值對比分析

3 討論

中醫絡病學將絡脈分為“氣絡”和“脈絡”。“氣絡”與“神經—免疫—內分泌”有關，“脈絡”則與微循環及血管再生相關。腦絡是為絡脈的一部分[11]。一般認為，顱腦內細胞及分子信號通道、神經傳導、神經突觸連接、神經遞質、神經免疫等均屬腦之“氣絡”范疇，而腦內側枝循環、血管再生相關的因子應屬“脈絡”的范疇。廣義的毒邪則包含虛、氣、血、痰、瘀、風等病理因素均參與了“毒”邪產生過程[12]，目前認為，西醫的“缺血級聯反應”為“毒損腦絡”病機提供了一定的現代生物學的依據[13]。本研究采用多發性腦梗死動物模型，有研究表明多發性腦梗死動物模型與多發性腦梗死癡呆模型造模方法相同，多發性腦梗死動物模型大鼠空間辨別能力下降，近期記憶減退，學習獲得能力及保持能力均有下降[14]，體內實驗表明，中劑量黃連解毒湯即可顯著增強全腦缺血模型小鼠對新奇物體的分辨能力，并提高小鼠海馬CA1 區的功能神經元細胞的密度[15]。同時研究還表明，黃連解毒湯提取物具有抗自由基、提高乙酰膽堿含量、改善腦血流量，對血管性癡呆具有一定的治療作用[16]。

本研究中我們從“氣絡”的角度研究了與卒中后認知障礙相關 Notch 信號通道。結果表明，缺血性卒中可以激活Notch 信號通道。在體實驗表明，通過抑制Notch 信號通路，減少缺氧腦組織中TLR4、MyD88、TNF 等因子的表達，減少NF-kB 的表達和轉位，從而減輕大腦神經元的炎性損傷[17]。體外實驗表明，N9 細胞可表達Notch 信號通路受體Notch1，及配體Jagged2、Dll-1、Dll-4 及下游基因Hes1、Hes5，Notch信號通路參與調控小膠質細胞的極化。Notch 信號通路對小膠質細胞的調控效應，有可能因被“記憶”而長期存在[18]。本研究表明，黃連解毒湯能夠在一定程度上抑制Notch 信號通路的激活，改善卒中后認知功能。24 h 黃連解毒湯組逃避潛伏期及空間檢測能力明顯優于7 d 黃連解毒湯組。說明盡早應用“解毒”藥物，盡快抑制小膠質細胞的極化，對改善其認知功能有重要的意義。同時，JAK/STAT3 信號通路同樣是一個參與缺血再灌注損傷后的關鍵炎性途徑，與記憶功能有著重要的關系[19]，一旦發生腦缺血損傷，JAK2-STAT3信號通路可被激活，STAT3 活化后促使LTD 增加，導致LTP 和LTD 的平衡發生失調，最終導致突觸可塑性下降。實驗表明，通過抑制JAK2 磷酸化，從而阻滯STAT3 活化并阻滯STAT3 的釋放可促使LTD 減少，進而使LTP 和LTD 保持動態平衡，改善實驗大鼠的空間記憶損害[20]。該研究表明，黃連解毒湯同樣能抑制STAT3 的活化。

在“脈絡”方面，我們研究了黃連解毒湯對于皮層區梗死周圍腦血管新生方面的作用，VEGF 在血管新生中發揮著極為重要的作用。VEGF 表達增加最早在梗死發生3 h 后即可檢測到，可一直持續到3 d 或7 d[21]。本實驗發現，即使造模28 d 后，各模型組的VEGF 表達仍高于假手術組，但治療組及對照組與假手術組間對比未見顯著性差異。一方面考慮與每組檢測樣本量偏少有關，同時也與梗死后間隔時間較長有關。血管內皮細胞分化尖端細胞和莖細胞受 VEGF 和Notch 信號通路的共同調節，VEGF 是血管新生的正反饋調節因素，而通過誘導配體Dll4 的表達而啟動 Notch信號通道則作為負反饋調節因素，可有效預防過量血管的形成，二者的相互作用，可使血管保持在合理的比例內并發揮其功能[6,22]。由于本研究是基于認知障礙而設計，其相關蛋白及信號通道為治療后28 d 的結果，尚難以說明梗死早期階段黃連解毒湯對VEGF 的作用及Notch 信號通道的影響作用如何，這也為本研究的進一步深入提供了方向。

通過本研究我們可以看到早期采用黃連解毒湯可以改善模型大鼠的行為學，在一定程度上是通過抑制Notch 及STAT3 信號通路，減少其梗死區周圍的神經元凋亡來實現的。研究結果表明，在卒中后盡早使用黃連解毒湯具有預防卒中后認知障礙出現或進一步發展的作用，解毒治療也有其“時間窗”。