胡桃醌對小鼠SH-SY5Y 神經母細胞瘤干預后相關差異基因表達變化及通路分析

李慶杰，王若汗，馮佳亮，張 行，王法宇，連樹林*

（1.長春中醫藥大學附屬醫院，長春 130021；2.長春工業大學化學與生命科學學院，長春 130012；3.北京醫藥集團職工大學中藥系，北京 100079）

胡桃楸是民間習用傳統中藥，含有醌類及苷、黃酮類、鞣質類及三萜類等化學物質，并具有較強的抗腫瘤、抗氧化、抗菌和鎮痛等作用[1]。其中胡桃醌是胡桃楸的重要活性物質，胡桃醌屬于萘醌類化合物，萘醌類藥物很早就應有于癌癥、胃病、心血管疾病等多種疾病的治療[2-3]。WEN 等[4]通過實驗發現，胡桃醌具有抗癌的作用，可以降低大鼠小腸癌癥的發病率。左瑞庭等[5]通過實驗發現，胡桃醌可通過調節Akt 磷酸化來調控p21 表達，進而調節A-FLSs 增殖和凋亡過程。本文以小鼠SH-SY5Y 神經母細胞瘤為研究對象，采用轉錄組學技術，對胡桃醌干預后的差異基因表達情況進行分析，旨在探討胡桃醌抗腫瘤機制，為胡桃醌抗腫瘤新藥的開發奠定基礎。

1 實驗材料

胡桃醌（由青龍衣中分離純化得到，經HPLC 檢測純度達96%以上）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI 1640 培養基（Invitrogen 公司）；胰酶（Invitrogen 公司）；Na2HPO4·H2O，KH2PO4，NaCl，KCl，二甲基亞砜（DMSO）等（北京化工廠，分析純）；CCK8 試劑盒（Sigma 公司）。SHSY5Y 小鼠神經母細胞瘤，由長春中醫藥大學附屬醫院實驗研究中心分子生物學實驗室提供。INFINITE M200 酶標儀（瑞士TECAN），IX71 倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS），MILI Q 超純水器（美國MILLIPORE），二氧化碳培養箱（美國 THERMO），SW-CJ-1F 超凈臺（上海博迅實業有限公司），LD5-2B 離心機（北京雷勃爾離心機有限公司），BCD-215TD GA 冰箱（海爾集團），BSA224S 電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司，北京），LDZX-30KBS 型蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械有限公司）高效液相色譜儀LC-20AT（日本島津）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 SH-SY5Y 小鼠神經母細胞瘤細胞培養于含10% 胎牛血清（fatal bovine serum，FBS）的DMEM 培養基中，37 ℃，飽和濕度，5% CO2培養。每周更換培養基3 次，0.125%胰蛋白酶工作液消化分散細胞，進行傳代培養。

2.2 胡桃醌樣品溶液的制備 準確稱取胡桃醌樣品10 mg，加入PBS 2 mL，超聲處理（功率100 W，頻率50 KHz）10 min，0.22 μm 濾膜濾過除菌，制成5 mg/mL樣品儲備液，低溫保存，用前以培養液稀釋至所需濃度。

2.3 CCK8 法測定細胞存活率 將處于對數生長期的SH-SY5Y 細胞以7×104的濃度接種至96 孔板，每孔100 μL 培養液，37 ℃飽和濕度，5% CO2培養24 h，空白組加入培養液100 μL，對照組加入HCPT 母液100 μL 樣品孔加入胡桃醌溶液100 μL 使終濃度為1.5、3、6、12.5、25、50、100、200、300、400 μg/mL，每個濃度設3 個復孔。置培養箱中培養24 h 后，加入CCK8 溶液10 μL，繼續培養2 h，取出培養板，酶標儀450 nm 測定各孔吸收值A。

細胞存活率=（A樣品-A空白）/（A對照-A空白）×100%。

2.4 Westem-blot 方法 SH-SY5Y 細胞采用Novagen公司的Cytobnster 提取細胞總蛋白，提取蛋白經10%SD S-PAGE 分離膠和5%濃縮膠分離后，通過濕轉的方法將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜以含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉2 h，加入相應一抗4 ℃旋轉孵育過夜。次日采用0.1% TBST 洗膜3次，5 min/次，加入山羊抗兔/鼠的HRP 標記二抗，室溫旋轉孵育1 h；0.1% TBST 洗膜3 次，5 min/次；硝酸纖維素膜以Supersignal WestFem 化學發光底物對條帶進行顯色。Actiti 作為內參對照。所有實驗至少重復3 次。

2.5 RT-PCR 檢測p53 mRNA 表達水平 按試劑盒說明提取總RNA，RT-PCR 按說明書進行，擴增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30 循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產物用含0.5 mg/L 溴化乙錠的15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳進行，最后用凝膠成像系統Quan-tity one 軟件分析結果，p53 與GAPDH 條帶的相對含量比值表示。GAPDH，p53 的引物及擴增片段長度見表1。

表1 PCR 引物序列和產物長度

2.6 統計學方法 采用Graphpad 軟件進行數據分析。多組數據間比較采用Anova 檢驗。

3 結果

3.1 胡桃醌對SH-SY5Y 細胞存活率的影響 胡桃醌對SH-SY5Y 細胞活性具有明顯的抑制效果，且呈劑量依賴性，隨著胡桃醌濃度的升高，對細胞活性的抑制效果增強，濃度在25 μg/mL時細胞存活率明顯下降，且在胡桃醌濃度達到200 μg/mL 時，細胞存活率接近50%，且組間差異有統計學意義（P＜0.05），因此選擇25、50、100、200 μg/mL 濃度進行后期實驗。見表2。

表2 胡桃醌不同濃度（μg/mL）對SH-SY5Y 細胞存活率的影響（，n=3） %

表2 胡桃醌不同濃度（μg/mL）對SH-SY5Y 細胞存活率的影響（，n=3） %

3.2 轉錄組學技術篩選差異表達基因及KEGG 通路分析 差異表達基因的鑒定采用 R with edgeR package；當qvalue ＜0.05，定為差異表達基因。logFC 為差異倍數的log2 轉換值（=1 時表示2 的+1次方，表示該基因在處理vs 對照相比，上調了2 倍）。通過處理組與對照組分析，共找到821 個顯著性差異的基因。根據研究目的通過KEGG 注釋，找到p53信號通路。p53 基因是人體抑癌基因。該基因編碼一種分子量為53kDa 的蛋白質，命名為p53。p53 蛋白由393 個氨基酸組成，具有特異的轉錄激活作用。p53 是一種腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene）。由這種基因編碼的蛋白質（protein）是一種轉錄因子（transcriptional factor），其控制著細胞周期的啟動。許多有關細胞健康的信號向p53 蛋白發送。關于是否開始細胞分裂就由這個蛋白決定。如果這個細胞受損，又不能得到修復，則p53 蛋白將參與啟動過程，使這個細胞在細胞凋亡（apoptosis）中死去。有p53 缺陷的細胞沒有這種控制，甚至在不利條件下繼續分裂。像所有其他腫瘤抑制因子一樣，p53 基因在正常情況下對細胞分裂起著減慢或監視的作用。細胞中抑制癌變的基因“p53”會判斷DNA 變異的程度，如果變異較小，這種基因就促使細胞自我修復，若DNA 變異較大，“p53”就誘導細胞凋亡。p53 是重要的腫瘤抑制基因。

3.3 p53 信號通路中p53 蛋白表達情況分析 Western-blot 結果所示，與對照組相比，SHSY5Y 細胞凋亡相關基因p53 蛋白表達水平在加入胡桃醌作用后顯著上調，且與胡桃醌濃度呈劑量依賴關系，其表達量隨著胡桃醌濃度的升高而升高，組間差異顯著（P＜0.05）。見圖2，表3。

3.4 胡桃醌對SH-SY5Y 細胞p53 mRNA 表達的影響 經RT-PCR 方法檢測p53 mRNA 表達變化，不同濃度胡桃醌誘導SH-SY5Y 細胞凋亡后p53 基因mRNA表達水平明顯增強，且與胡桃醌濃度呈劑量依賴關系，其表達量隨著胡桃醌濃度的升高而升高，組間差異顯著（P＜0.05）。結果見表4。

圖2 p53 基因蛋白表達水平檢測結果

表3 胡桃醌對SH-SY5Y 細胞p53 表達影響（，n =3） %

表3 胡桃醌對SH-SY5Y 細胞p53 表達影響（，n =3） %

表4 胡桃醌對SH-SY5Y 細胞p53 mRNA 表達影響（，n =3） %

表4 胡桃醌對SH-SY5Y 細胞p53 mRNA 表達影響（，n =3） %

4 討論

細胞凋亡是由多個信號通路調控的一個程序性細胞死亡過程[6-7]。在多數細胞類型中，p53 是重要的細胞凋亡調節因子，p53 基因介導的細胞信號轉導途徑在調節細胞正常生命活動中起重要作用，與細胞凋亡密切相關[8-9]。腫瘤抑制因子p53 在刺激下可調節細胞周期或細胞凋亡，促進p53 轉錄促凋亡基因，從而引起細胞凋亡。胡桃醌具有一定的抗腫瘤活性[10-11]，可能與上調p53mRNA 及p53 的表達有關。p53 可以轉錄活化許多靶基因，如p21，Bax，Bid，Puma 等，p53 也通過轉錄非依賴的形式來調節細胞凋亡，并能夠直接激活Bax，誘導Bax 寡聚[12-13]。胡桃醌可抑制人乳腺癌MCF-7 細胞的增殖。該研究證明了細胞中自由基的提升與胡桃醌有關，并且在胡桃醌誘導下破壞線粒體膜結構從而引起caspase 活化，最終導致細胞凋亡[14-15]。另外，p53 能夠將Bax 從Bax-Bcl 的復合物中置換出來。在本實驗中，我們分別應用RT-PCR 和Western-blot 方法檢測了p53mRNA及p53 表達水平，分析結果顯示，胡桃醌能明顯上調p53 mRNA 及p53 的表達，誘導細胞凋亡[16-18]。

綜述所述，本研究結果證實了胡桃醌導致SHSY5Y 細胞凋亡的機制可能是誘導細胞凋亡水平而發揮的，與調節凋亡相關基因p53 表達相關。