杜仲黃酮對糖尿病腎病小鼠Nrf2/HO-1 氧化應激信號通路的影響

許碧琪，戴燕青，傅倩云，梁 韜

（1.浙江大學醫學院附屬兒童醫院，杭州 310000；2.廣西醫科大學附屬口腔醫院，南寧 530021）

糖尿病是導致終末期腎病發生的重要危險因素。糖尿病腎病（DN）是患者在長期慢性高血糖環境下出現的以腎小球濾過率異常和持續出現尿蛋白為特征的微血管并發癥[1]。目前多采用控制血糖、調節血脂、抗氧化、血管緊張素轉化酶抑制劑和鈣拮抗劑等綜合治療，但仍難以阻止腎功能的持續減退[2-3]。有研究發現，Nrf2/HO-1 信號通路的激活可減少腎臟組織的氧化應激，保護腎組織，延緩糖尿病腎病的進展[4]。杜仲黃酮為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）的干燥樹皮中提取的主要成分。有研究表明，杜仲及杜仲黃酮可降低糖尿病小鼠空腹血糖，并有良好的抗氧化作用[5-7]，但其具體的相關作用機制尚未清楚。因此，本研究基于前期預實驗結果，采用低濃度鏈脲佐菌素及高脂高糖誘導的糖尿病腎病小鼠體內模型探討杜仲黃酮是否能通過調節氧化應激信號通路Nrf2/HO-1 的表達來達到抗氧化作用，以期為糖尿病腎病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級，體質量18～22 g 的昆明種雄性小鼠，購自浙江大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（浙）2013-0023。小鼠飼養于通風良好的環境，室溫18～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h 光照晝夜循環。實驗開始前小鼠進行適應性喂養1 周。

1.2 藥品與試劑 纈沙坦片（北京京豐制藥有限公司，批號：180113）；鏈脲佐菌素（美國Sigma 公司，批號：B1863）；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20181123）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20181030）；丙二醛（MDA）測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：20181117）；預染蛋白Marker（西安潤德生物技術有限公司，批號：QE19514）；Nrf2、HO-1 蛋白抗體（武漢博士德有限公司，批號：2891904）；HRP 標記的兔抗羊IgG 抗體（Santa Cruz Biotechnology，批號：CV20190425）；多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology，批號：SC-1903）。

1.3 杜仲黃酮提取 采用醇提取法提取杜仲黃酮。首先將干燥杜仲進行充分粉碎，粉碎藥材置于容器中采用70%乙醇（藥材:70%乙醇=1:15），在80 ℃條件下加熱回流提取2 h，連續提取3 次。將提取液進行過濾濃縮，最后可獲得干燥杜仲黃酮提取物。

2 方法

2.1 糖尿病模型建立和給藥[8]取60 只昆明種雄性小鼠，鏈脲佐菌素采用冷藏枸櫞酸緩沖液現配現用，存放于冷藏避光環境中，低濃度鏈脲佐菌素（STZ）（40 mg/kg）尾靜脈注射入小鼠體內，每天注射1 次，連續注射3 d。末次注射72 h 后檢測空腹血糖，以空腹血糖≥11.1 mmol/L 為糖尿病模型，將糖尿病模型小鼠繼續給藥高脂高糖飲食60 d 后，檢驗小鼠尿液，尿蛋白陽性小鼠視為糖尿病腎病模型成功。并另取10 只昆明小鼠作為空白對照。糖尿病腎病小鼠隨機分為模型對照組、纈沙坦對照組[20 mg/（kg·d）]、杜仲黃酮低、高劑量組[80、160 mg/（kg·d）]。各組小鼠灌胃給予相應藥物，模型組和空白組小鼠給予等量生理鹽水，連續給藥60 d。

2.2 指標測定 末次給藥后2 h，檢測小鼠空腹血糖。并收集24 h 尿液，取其全血離心獲得血清標本，摘取腎臟組織。血清及腎臟組織儲存于-80 ℃環境中。其中血清用于檢測小鼠腎功能指標血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN），尿液用于檢測尿蛋白，腎功能指標檢測采用全自動生化分析儀進行測定。部分腎臟組織進行勻漿，采用試劑盒檢測SOD 活性和MDA 含量，部分腎臟組織采用Western blotting 檢測Nrf2 和HO-1 蛋白表達情況。

2.3 Western blotting 檢測相關蛋白表達[9]向腎組織中加入RIPA裂解液，放入高通量組織研磨器中進行研磨，冰水上靜置1 h 后，4 ℃溫度下，以1.2×104r/min 轉速離心10 min。取上清進行BCA 蛋白定量、煮蛋白。配制10% SDS-PAGE 凝膠，經過上樣、電泳、轉膜、封閉后，進行剪膜，加入特異性一抗，4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜后，加入與一抗對應來源的二抗室溫慢搖1 h，再用TBST 洗，用ECL 發光液進行顯色，化學發光成像儀曝光。Image J 進行灰度分析。

3 結果

3.1 各組小鼠血糖水平 結果見表1。

表1 杜仲黃酮對糖尿病腎病小鼠空腹血糖的影響

3.2 各組小鼠腎功能指標變化 結果見表2。

表2 杜仲黃酮對糖尿病腎病小鼠血清腎功能指標的影響

3.3 各組小鼠腎臟氧化應激水平 結果見表3。

表3 杜仲黃酮對糖尿病腎病小鼠腎臟氧化應激功能的影響

3.4 杜仲黃酮對各組小鼠腎組織中Nrf2、HO-1 蛋白表達的影響 結果見表4 和圖1。

表4 杜仲黃酮對糖尿病腎病小鼠Nrf2、HO-1蛋白表達的影響

圖1 杜仲黃酮對各組小鼠腎組織中Nrf2、HO-1蛋白表達的影響

4 討論

氧化失衡是糖尿病腎病的重要病理機制。在糖尿病患者長期高糖內環境下，氧化應激通過蛋白激酶C途徑和多元醇等途徑激發晚期糖基化終末產物的積聚，引起腎小球超濾過、系膜擴張、基底膜增厚和內皮細胞紊亂，繼而誘發糖尿病腎病[10-11]。Nrf2 被稱為“多器官保護器”，其抗氧化反應元件途徑激活可保護各細胞和組織器官免受氧化應激的毒性損害[12-13]。

Nrf2 屬于堿性亮氨酸拉鏈家族中的一種核轉錄因子。廣泛存在于心臟、肺、肝、心肌和腎臟組織器官中。可通過誘導基因編碼抗氧化酶起到抗炎、抗氧化作用[14]。正常狀態下Nrf2 保持低轉錄水平，Nrf2 的活性依賴于鋅指樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）負性調節。在氧化應激條件下，Keap1 結構域中的半胱氨酸殘基被修飾進而構象發生變化，促使Nrf2 的結合位點發生解聯，進而推動Nrf2與抗氧化元件（ARE）結合，激活靶基因，最后調控II 相解毒酶和抗氧化酶HO-1、SOD 和過氧化氫酶（CAT）等的活性及MDA 的表達，發揮抗氧化應激作用[15-16]，從而提高機體抗氧化應激的能力。

研究發現，糖尿病患者體內氧化失衡伴隨著Nrf2活性降低，推測Nrf2 介導氧化應激水平的升高。有報道稱，Nrf2 敲除的糖尿病腎病小鼠中ROS 大量積聚，造成腎損害[17]。Chen F 等人也發現糖尿病腎病大鼠中膠原形成和腎間質纖維化可被柚皮苷所改善，其機制與激活Nrf2 有關。Nrf2 已被視為治療糖尿病腎病的潛在靶點[18]。抗氧化酶HO-1 是Nrf2 的下游蛋白，是血紅素降解中的關鍵酶，可催化血紅蛋白降解產生膽綠素和CO 等產物，該產物能有效降低炎癥反應和氧化應激損傷，對細胞起保護作用[19-20]。這些研究表明，誘導激活Nrf2/HO-1 通路可減少氧化應激對腎臟的損傷。

杜仲黃酮是杜仲科植物杜仲的干燥樹皮中提取的主要成分。隨著對杜仲有效成分的深入研究發現，杜仲有較強的抗氧化活性和降血糖等作用，而杜仲提取物中含有大量黃酮類物質。故本研究探討杜仲黃酮對糖尿病腎病小鼠氧化應激信號通路的影響。研究結果發現，糖尿病腎病小鼠經杜仲黃酮干預后，血糖明顯下降，血清腎功能指標有所改善，還伴隨有腎臟組織SOD 活性升高，MDA 摩爾濃度降低。這提示我們，杜仲黃酮可改善糖尿病腎病小鼠體內的氧化應激狀態。隨著深入研究發現，杜仲黃酮可激活氧化應激相關通路Nrf2 和HO-1 蛋白表達。

綜上所述，杜仲黃酮對糖尿病腎病小鼠腎臟的保護作用可能與其激活Nrf2 通路，上調下游因子HO-1表達，提高機體抗氧化的能力，進而降低腎臟組織中氧化應激損傷，而起到腎臟保護作用。