解毒通絡(luò)益腎濃縮丸提取工藝的優(yōu)化

關(guān)安琦，高英鑫，王 琳，高 寒，邱智東，徐 偉

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117）

解毒通絡(luò)益腎方是長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院全國(guó)名中醫(yī)南征教授臨床實(shí)踐50 余載的經(jīng)驗(yàn)方，在治療糖尿病腎病方面有較好的療效[1-2]。為便于患者使用，我們將此方開(kāi)發(fā)制成濃縮丸。本文對(duì)解毒通絡(luò)益腎濃縮丸的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

解毒通絡(luò)益腎濃縮丸中有榛子花、大黃、土茯苓等十味中藥材，臨床使用方式為煎煮法，故提取方法采用水煎煮。在實(shí)驗(yàn)中利用LC-MS/MS 對(duì)水煎液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中大黃酸、大黃素含量較高，且有研究表明，大黃酸[3]、大黃素[4]在治療糖尿病腎病方面具有較好的活性，故以大黃酸、大黃素的含量作為優(yōu)化工藝的考察指標(biāo)。目前工藝優(yōu)選中多采用正交試驗(yàn)法，但由于它不能在給出的區(qū)域上得到回歸方程，即不能明確因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，進(jìn)而不能得到整個(gè)區(qū)域上因素的最佳水平和響應(yīng)值的最優(yōu)值。響應(yīng)面曲線法能滿足上述的要求，可提高數(shù)學(xué)模型的預(yù)測(cè)性，更好的體現(xiàn)各因素、各指標(biāo)與效應(yīng)值的關(guān)系[5-7]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇響應(yīng)面曲線法優(yōu)化解毒通絡(luò)益腎濃縮丸的水提工藝。

1 儀器與試藥

LC2030 系列高效液相色譜儀、LCMS-8040 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司）、New Classic MS電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、KQ-500B 型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市江南儀器廠）、SHZD(III)循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）、Smart2Pure超純水機(jī)（Thermo-Scientific）。榛子花、大黃、土茯苓等10 味藥材均由吉林省北藥藥材基地提供，經(jīng)檢驗(yàn)均為正品；大黃酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110757-201607，含量：≥99.3%）、大黃素（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110756-201512 含量：≥98.7%）。甲醇（北京化工廠）、甲酸（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）、色譜甲醇（Fisher）、色譜乙腈（Fisher）。

2 方法與結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件 Agilent 5 TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～5 min，5% →15% B；5～30 min，15%→35% B；30～40 min，35%→42% B；40～60 min，42%→80% B；離子源：電噴霧（ESI）；檢測(cè)模式：正負(fù)離子檢測(cè)；掃描方式：MRM 掃描。經(jīng)分析，浸膏粉中含有大黃酸、大黃素2種成分，見(jiàn)表1。

表1 2種化合物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

2.2 色譜條件 Agilent 5 TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～3 min，85%→68% B；3～10.5 min，68% B；10.5～13 min，68%→80% B；13～26 min，80% B。

2.3 樣品的制備 按比例稱(chēng)取處方中藥材共140 g（榛子花、大黃、土茯苓等），分別以不同水提工藝條件進(jìn)行水煎煮提取，濾過(guò)，濾液濃縮，干燥，粉碎，即得。

2.3.1 供試品的制備 取樣品粉末2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理1 h，放冷，稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 對(duì)照品的制備 精密稱(chēng)取大黃酸、大黃素對(duì)照品，加甲醇分別制成每1 mL 含大黃酸、大黃素各80 μg 的溶液，分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各2 mL，定容至10 mL（每1 mL 含大黃酸、大黃素16 μg），即得。

2.4 煎煮工藝考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱(chēng)取大黃酸、大黃素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含有大黃酸分別為8、16、24、32、40、48 μg，含大黃素分別為2、4、6、8、10、12 μg的溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，大黃酸：Y=379 01X+139 61，R2=0.999 0；大黃素：Y=40 580X-476.5，R2=0.999 8。

2.4.2 精密度 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下配置的大黃酸、大黃素混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，大黃酸和大黃素峰面積的RSD 分別為0.29%、0.32%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性 按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6 份，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，大黃酸和大黃素峰面積的RSD 分別為0.42%、0.35%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性 取“2.4.3”項(xiàng)下1 號(hào)供試品溶液，分別于室溫下放置0、3、6、12、24、48 h 后分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，大黃酸和大黃素峰面積的RSD 分別為1.67%、0.15%（n=6），表明供試品溶液在室溫條件下放置48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率 取已知大黃酸和大黃素含量的供試品6 份，分別加入大黃酸對(duì)照品1.07 mg 和大黃素對(duì)照品0.15 mg，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果，大黃酸、大黃素的平均回收率分別為99.10%、100.04%，RSD 分別為1.06%、1.40%（n=6）。

2.4.6 響應(yīng)面曲線分析 以煎煮時(shí)間（min）、煎煮次數(shù)（次）、加水量（倍）為自變量，以大黃酸、大黃素的總提取量為響應(yīng)值，采用Design-Expert8.0.6 軟件，設(shè)計(jì)得到三因素三水平組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每組平行測(cè)定2 次，取平均值。因素與水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

響應(yīng)值=大黃酸提取量×50%+大黃素提取量×50%

表2 工藝優(yōu)化的因素水平

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

以方中大黃酸、大黃素的總得率為響應(yīng)值，用Design-Expert8.0.6 軟件對(duì)表3 的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得到回歸方程為，總提取量=3.607 75+6.171A+3.424 5B-0.353C+0.865AB+0.947 5AC-0.088 75BC-4.917A2-0.594 25B2-0.022 313C2，方差分析見(jiàn)表4。由表4 可知，模型P＜0.01；決定系數(shù)R2為0.983 1,因素A、AB 有顯著性差異（P＜0.05），B、C、AC、A2、B2有極顯著差異（P＜0.01），失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型擬合度好，可以用于優(yōu)化。

表4 方差分析

為評(píng)價(jià)提取時(shí)間與提取次數(shù)（AB）、提取次數(shù)與加水量（BC）、提取時(shí)間與提取次數(shù)（AC）交互作用對(duì)大黃酸、大黃素總得率的顯著影響，及確定各因素的最佳水平范圍，分別繪制響應(yīng)面圖和等高線圖。確定最優(yōu)工藝為8 倍量水煎煮2 次，每次1.5 h。

3 討論

3.1 考察指標(biāo)的選擇 經(jīng)查閱文獻(xiàn)得，總蒽醌中的大黃酸、大黃素在治療糖尿病腎病的過(guò)程中有較好的療效。通過(guò)LC-MS/MS 分析得出，水煎后供試品中大黃酸及大黃素含量較高，故選擇以大黃酸、大黃素含量為考察指標(biāo)優(yōu)化水提方法。

3.2 質(zhì)譜和液相試驗(yàn)條件的選擇 在LC-MS/MS 中，嘗試采用正負(fù)離子2種模式，結(jié)果顯示在負(fù)離子模式下離子化效應(yīng)較好，故選擇負(fù)離子模式；在HPLC 中，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[8]，確定2種成分在254 nm 處有最大吸收波長(zhǎng)，故采用254 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本文采用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，確定的最佳工藝的預(yù)測(cè)值與理論值的偏差僅為3.29，表明擬合模型合理準(zhǔn)確，可用于優(yōu)選解毒通絡(luò)益腎濃縮丸水提工藝。