腫節(jié)風(fēng)內(nèi)生真菌的分離鑒定及拮抗真菌篩選

宋利沙，蔣 妮，2*，藍(lán)祖栽，張占江

(1.廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023；2.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

【研究意義】內(nèi)生真菌是生活在植物健康組織和器官及生活史的某一特定時期、未對植物組織產(chǎn)生明顯病害癥狀的一類真菌，種類繁多，分布廣泛[1]。近年來的研究表明，從健康藥用植物不同組織器官中分離到的內(nèi)生真菌，通過不同培養(yǎng)基可篩選出很多產(chǎn)生抑制病原真菌活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌[2-5]。腫節(jié)風(fēng)為金粟蘭科草珊瑚屬多年生草本植物草珊瑚[Sarcandraglabra(Thunb.) Nakai]的干燥全草，不但具有清熱涼血、活血消斑、祛風(fēng)通絡(luò)等功效[6-7]，還具有抗菌消炎、抑制流感病毒、抗腫瘤、促進(jìn)骨折愈合及鎮(zhèn)痛等多種活性成分，急性毒性試驗結(jié)果顯示無毒[8]。以腫節(jié)風(fēng)為主要原料的制劑有草珊瑚含片、腫節(jié)風(fēng)片、腫節(jié)風(fēng)注射液和血康口服液等[9]，但迄今對腫節(jié)風(fēng)內(nèi)生真菌抗菌活性的研究較少。因此，分析腫節(jié)風(fēng)的內(nèi)生真菌多樣性，篩選具有較強抗菌活性的菌株，對尋找新型抗菌和抗腫瘤活性成分原材料具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】Supaphon等[10]從3種藥用海草中分離和鑒定了160種內(nèi)生真菌，并研究其抗菌活性。Gupta等[11]研究發(fā)現(xiàn)姜黃(Curcumalonga)的內(nèi)生真菌莖點霉菌(Phomaherbarum)具有拮抗葉斑病活性。Jin等[12]在人參中分離到兩株具有抗菌活性且可用于發(fā)酵制備人參皂苷等成分的內(nèi)生真菌[PN8(Fusariumsp.)和PN17(Aspergillussp.)]；Katoch等[13]從印度芳香植物檸檬馬薄荷(Monardacitriodora)分離到28株內(nèi)生真菌，分別來自11個屬，其中鐮刀菌(Fusarium)、黃曲霉(Aspergillusflavus)和Muscodor等具有開發(fā)為植物生物防治物質(zhì)的潛力；Tanapichatsakul等[14]從傳統(tǒng)藥用植物Melodorumfruticosum的花中分離得到52株內(nèi)生真菌，其中間座殼菌(Diaporthespp.)具有抗菌作用。陳娟等[15]從天山雪蓮和紅景天的根內(nèi)分離到34株內(nèi)生真菌，其中深色有隔內(nèi)生真菌為優(yōu)勢菌群；農(nóng)倩等[16]報道深色有隔內(nèi)生真菌對香蕉枯萎病菌具有抑制作用；譙利軍等[17]對不同地區(qū)及不同季節(jié)的健康馬比木不同組織部位樣本進(jìn)行內(nèi)生真菌多樣性分析，分離出1037株內(nèi)生真菌，分別隸屬于30個屬，其中間殼座屬為優(yōu)勢屬；元超等[18]從艾納香分離到內(nèi)生真菌間殼座屬對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KCTC 1021具有非常強的抑制活性；鄭瑞等[19]從蛇足石杉分離到一株無盤柄盤菌(Peziculasp.)JR14，其次生代謝產(chǎn)物對乙酰膽堿酯酶具有抑制活性；王佳瑩[20]從金鐘花莖稈中分離到含有抗菌活性代謝產(chǎn)物的無柄盤菌屬內(nèi)生真菌；周麗思等[21]從藥用植物丹參內(nèi)生真菌中獲得1株對丹參生長和丹酚酸含量具有顯著促進(jìn)作用活性的菌株；劉軍生等[22]從七葉樹(Aesculuschinensis)根和莖中分離出1株具有高產(chǎn)七葉皂苷C的內(nèi)生真菌，其發(fā)酵液提取物具有抑菌活性；宋利沙等[23]從健康腫節(jié)風(fēng)根系土壤中篩選出對腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌(Colletotrichumdematium)及14種其他植物病原真菌具有較強抑制作用的真菌。【本研究切入點】目前，對藥用植物腫節(jié)風(fēng)根、莖、葉中的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離、鑒定并篩選出抗菌活性強內(nèi)生真菌菌株的研究未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】對腫節(jié)風(fēng)根、莖、葉中的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離和鑒定，并篩選出抗菌活性強的內(nèi)生真菌菌株，為開發(fā)新的抗菌藥物資源打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試樣品 于2018年10-12月，在廣西融安、都安、靖西和南寧等地采集腫節(jié)風(fēng)健康植株的根、莖和葉，編號后封存于保鮮袋中，48 h內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生真菌分離。

1.1.2 供試指示菌 供試指示菌為病原真菌，共15種，分別為三七灰霉病菌(Botrytissp.)、三七根腐病菌(Fusariumsolani)、豆蔻葉斑病菌(Phyllostictasp.)、香蕉葉斑病菌(Alternariasp.)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、苦玄參葉斑病菌(Alternariasp.)、香蕉炭疽病菌(Colltetorrichumsp.)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、三七黑斑病菌(Alternariapanax)、廣西莪術(shù)葉斑病菌(Phomopsissp.)、煙草灰霉病菌(Botrytiscinerea)、三七炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)、艾納香褐斑病菌(Phomasp.)、腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌和羅漢果葉斑病菌Stagonosporopsiscucurbitacearum，均由廣西藥用植物園植物病理研究室保存提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 L，用于植物病原真菌培養(yǎng)和菌株拮抗效果測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)生真菌分離和純化 采用常規(guī)組織分離法并參考Guo等[24]的方法(稍有改進(jìn))進(jìn)行腫節(jié)風(fēng)的根、莖和葉內(nèi)生真菌分離和純化，純化后的菌株保藏于廣西藥用植物園植物病理研究室。采用超凈工作臺無菌檢測法、漂洗液的無菌檢測法和組織印跡無菌檢測法檢測表面消毒是否徹底，以確保腫節(jié)風(fēng)內(nèi)生真菌準(zhǔn)確分離[25]。據(jù)菌落培養(yǎng)特征將分離、純化的內(nèi)生真菌劃分為不同的形態(tài)類型[26]。

1.2.2 拮抗內(nèi)生真菌篩選 采用平板對峙法[27]進(jìn)行拮抗真菌篩選，在直徑9 cm的PDA培養(yǎng)基中央接種直徑5 mm的病原菌菌餅，在離菌餅2 cm的3個角點等距離接種拮抗真菌，以只接種病原菌菌餅為對照。每處理設(shè)3次重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后測定菌落生長抑制率，篩選出對病原真菌有拮抗作用的內(nèi)生真菌。復(fù)篩與初篩方法相同。

菌落生長抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-病原菌菌餅直徑)×100

1.2.3 內(nèi)生真菌鑒定 參考方中達(dá)的方法[28]記錄菌落形態(tài)，參考魏景超的方法[29]和國際分類網(wǎng)站http://www.indexfungorum.org進(jìn)行菌落形態(tài)初步鑒定。參考Kumar等[30]的方法，利用MEGA 7.0的鄰位連接法構(gòu)建ITS rDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定：采用MightyAmp DNA Polymerase Ver.3(1.25 U/50 μl)試劑盒(Takara Bio Inc.，Japan，cat. no. R076A)，挑取培養(yǎng)內(nèi)生真菌的菌落作為模板直接用于PCR反應(yīng)，用凝膠成像法檢測目的條帶，將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序；測序結(jié)果與NCBI的GenBank中的序列進(jìn)行BLAST比對。

真菌種屬分類地位確定：目標(biāo)序列與參考序列進(jìn)行BLAST比對后，同源性≥95 %的暫定為同一個屬，相似性≥99 %的暫定為一個種。

1.2.4 內(nèi)生真菌抗菌譜測定 參考1.2.2的方法進(jìn)行抗菌譜測定，測量病原菌菌落的直徑和抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 腫節(jié)風(fēng)內(nèi)生真菌的分離和純化結(jié)果

通過常規(guī)組織法分離，從健康腫節(jié)風(fēng)的不同組織(根、莖和葉)分離到111株內(nèi)生真菌純化培養(yǎng)物，其中，從莖中分離到52株(即莖的分離率占46.85 %)，葉和根分別分離到38和21株。在111株內(nèi)生真菌中，從廣西南寧的材料分離純化到43株(根6株、莖22株、葉15株)，從融安的材料分離純化到18株(根4株、莖5株、葉9株)，從靖西的材料分離純化到18株(根6株、莖4株、葉8株)，從都安的材料分離純化到32株(根5株、莖21株、葉6株)，即從廣西南寧分離純化到的內(nèi)生真菌最多，其次是都安，靖西和融安的最少。從111株內(nèi)生真菌中選出不同形態(tài)類型菌株共42株進(jìn)行分子鑒定。各菌株名編號、種類、分離器官及GenBank登錄號等信息見表1。

表1 42株腫節(jié)風(fēng)內(nèi)生真菌菌株的種類信息

續(xù)表1 Continued table 1

菌株編號Strain number采樣地*Collection site登錄號Accession number器官Organ種類TaxonRG-4RMK429879根毛霉亞門真菌(Mucoromycotina sp. )JJ-1JMK429850莖新殼梭孢菌(Neofusicoccum parvum)DZ-8DMK429842莖柄孢殼菌屬真菌(Podospora sp. )DZ-8-1DMK429843莖尖孢刺盤孢菌(Colletotrichum acutatum)DZ-10DMK429844莖哈銳刺盤孢菌(Colletotrichum horii)DZ-20DMK429845莖球座菌屬真菌(Guignardia vaccinii)GJ-1GMK429867莖橡膠生擬莖點霉(Phomopsis heveicola)GJ-5GMK429868莖新殼梭孢屬真菌(Neofusicoccum brasiliense)GJ-8GMK429869莖蔥鏈格孢(Alternaria porri)GJ-8-2GMK429874莖暗色擬莖點霉(Diaporthe vaccinii)GJ-9GMK429870莖間座殼屬真菌(Diaporthe pseudomangiferae)GJ-11GMK429871莖間座殼屬真菌(Diaporthe eugeniae)GJ-14GMK429872莖多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)GJ-15GMK429873莖高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)RJ-1RMK429861莖橡膠生擬莖點霉(Phomopsis heveicola)RJ-2RMK429862莖橡膠生擬莖點霉(Phomopsis heveicola)RJ-3RMK429863莖擬莖點霉屬真菌(Phomopsis sp. )RJ-5RMK429864莖擴散炭墊菌(Nemania diffusa)RJ-6RMK429865莖間座殼屬真菌(Diaporthe hongkongensis)

注：*采樣地中的D代表都安縣，G代表南寧(廣西藥用植物園)，J代表靖西縣，R代表融安縣。

Note:*Collection locations，D stands for Du'an County，G stands for Nanning(Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants)，J stands for Jingxi county，and R stands for Rongan county.

2.2 基于ITS序列分析內(nèi)生真菌的分類地位

經(jīng)PCR擴增和測序，42株不同形態(tài)類型腫節(jié)風(fēng)內(nèi)生真菌的ITS序列與GenBank中的41株真菌參考序列(表2)相似性在99 %以上，分屬于3門9目20屬28種，其中，JY-8菌株鑒定到盤菌綱水平，DY-8鑒定到目水平，DY-5鑒定到炭角菌科水平，RG-4鑒定到毛霉亞門水平，DZ-8、RJ-3、JY-3和JG-1鑒定到屬水平，分別鑒定為柄孢殼菌屬(Podosporasp.)、擬莖點霉屬(Phomopsissp.)、多節(jié)孢屬(Nodulisporiumsp.)和被孢霉屬(Mortierellasp.)。

基于ITS rDNA序列構(gòu)建的腫節(jié)風(fēng)內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖1)顯示，42株內(nèi)生真菌分屬于10個分支，并有很高的支持率。JY-6、GY-12、GY-2和JY-9等4個菌株屬于糞殼菌綱(Pezizomycotina)亞門黑孢菌屬的種，與Nigrosporasphaerica和Nigrosporaoryzae等菌株相似率在99 %以上；JG-2、RY-3、GG-4、DY-3和RJ-5等5個菌株屬于糞殼菌綱炭角菌目(Xylariales)不同屬的種，JG-2鑒定為光輪層炭殼菌(Daldiniaeschscholtzii)，RY-3鑒定為草莓狀炭團菌(Hypoxylonfragiforme)，DY-3和RJ-5鑒定為Nemaniadiffusa，其中除GG-4與Xylariaberteri相似率達(dá)99 %外，其他菌株與所對應(yīng)種的相似率均達(dá)100 %；GY-13、DZ-8-1和DZ-10等3個菌株屬于糞殼菌綱(Glomerellales)目刺盤孢屬的種，GY-13和DZ-8-1分別鑒定為Colletotrichumboninense和Colletotrichumacutatum，DZ-10鑒定為哈銳炭疽菌(Colletotrichumhorii)，相似率均達(dá)100 %；RY-2、GJ-1、RJ-2、RJ-1、GYB-1、RY-4、GJ-8-2、RJ-6和GJ-9等9個菌株屬于糞殼菌綱間座殼目(Diaporthales)中的無性世代擬莖點霉屬和間座殼屬不同的種，RY-2、GJ-1、RJ-2和RJ-1等4個菌株鑒定為橡膠生擬莖點霉(Phomopsisheveicola)，GYB-1鑒定為Diaporthephaseolorum，RY-4、GJ-8-2、RJ-6和GJ-9等4個菌株分別鑒定為Diaporthevelutina、Diaporthevaccinii、Diaporthehongkongensis和Diaporthepseudomangiferae，相似率均達(dá)100 %；JG-4屬于糞殼菌綱糞殼菌目(Sordariales)毛殼菌屬的種，與Chaetomiumcupreum的相似性達(dá)100 %，鑒定為Chaetomiumcupreum；DZ-20、JJ-1和GJ-5等3個菌株屬于座囊菌綱(Dothideomycetes)葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)球座菌屬和殼梭孢屬的種，與對應(yīng)種GuignardiavacciniiFJ538353、NeofusicoccumparvumEU650672和NeofusicoccumbrasilienseMH809527的相似率達(dá)100 %，分別鑒定為G.vaccinii、新殼梭孢菌(N.parvum)和N.brasiliense；GJ-14、GJ-15和GJ-8等3個菌株屬于座囊菌綱(Dothideomycetes)格孢腔目(Pleosporales)棒孢菌屬、附球菌屬和鏈格孢屬不同的種，分別鑒定為Corynesporacassiicola、Epicoccumsorghinum和Alternariaporri；DY-6和DY-7分別鑒定為Leptosporarubella和Paraphomachrysanthemicola；JG-1屬于接合菌門(Zygomycota)毛菌綱毛霉目被孢霉科被孢霉屬，屬于Mortierellasp.，相似率均達(dá)100 %。

表2 參與系統(tǒng)分析的內(nèi)生真菌菌株種類、寄主、來源和登錄號

注：— 表示無數(shù)據(jù)。

Note:— represented no data.

Bootstrap values was more than 50 % support from 1000 re-samplings. Gaertneriomyces semiglobiferus AY997051 was used as outgroup圖1 基于ITS rDNA序列構(gòu)建的腫節(jié)風(fēng)內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of endophytic fungi of S. glabra based on ITS rDNA region sequences

從圖1可看出，優(yōu)勢菌群RY-2、GJ-1、RJ-2、RJ-1、GYB-1、RY-4、GJ-8-2、RJ-6和GJ-9等9個菌株屬于糞殼菌綱間座殼目(Diaporthales)中的無性世代擬莖點霉屬(Phomopsissp.)和間座殼屬(Diaporthesp.)的不同種；其次屬于糞殼菌綱炭角菌目Xylariales不同屬的種有JG-2、RY-3、GG-4、DY-3和RJ-5等5個菌株；屬于黑孢菌屬Nigrosporasp.的不同種有JY-6、GY-12、GY-2和JY-9等4個菌株；分屬于刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)的不同種有GY-13、DZ-8-1和DZ-10等3個菌株。

2.3 內(nèi)生真菌的抗菌活性測定結(jié)果

以廣西藥用植物園植物病理研究室所保存的15種病原真菌為指示菌，采用平板對峙法對111株腫節(jié)風(fēng)內(nèi)生真菌進(jìn)行抗菌活性測定，經(jīng)初篩和復(fù)篩發(fā)現(xiàn)，只有RJ-1和JJ-1對15種病原真菌有較高的抗性，抑制率在60 %以上(表3)。其中RJ-1和JJ-1菌株對三七灰霉病菌、三七根腐病菌、三七炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、艾納香褐斑病菌、苦玄參葉斑病菌和腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌等7種病原菌的抑制率均在80 %以上，具有強的抑菌廣譜性。

表3 拮抗真菌的抑菌譜

注：++++：菌落生長抑制率60 %～69 %；+++++：菌落生長抑制率70 %～79 %；++++++：菌落生長抑制率>80 %。

Note:++++：Colony growth inhibition rate 60 %-69 %；+++++：Colony growth inhibition rate 70 %-79 %；++++++：Colony growth inhibition rate>80 %.

3 討 論

本研究對廣西不同地區(qū)健康腫節(jié)風(fēng)不同組織的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離和鑒定，得到111株內(nèi)生真菌，選出其中的42個不同形態(tài)類型分屬于9目20屬的不同種，表明腫節(jié)風(fēng)中具有豐富的內(nèi)生真菌資源，與郭順星[1]研究指出內(nèi)生真菌存在于不同植物中并與宿主植物長期協(xié)同進(jìn)化、互利共生的觀點一致。許多內(nèi)生真菌不僅從宿主植物吸取營養(yǎng)物質(zhì)供給自身生長發(fā)育需要，而且還可提高宿主植物對環(huán)境脅迫的抗性，如抗病蟲害和抗干旱性等[1]。從健康腫節(jié)風(fēng)植株不同組織中分離得到的擬莖點霉屬(Phomopsis)和交鏈孢屬(Alternaria)常被認(rèn)為是植物的病原真菌[31-32]，然而近年來的研究表明，此2個屬所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物具有抑菌和防蟲作用[32-33]，有利于協(xié)助宿主植物抵御病原菌和不良生長環(huán)境。植物內(nèi)生真菌菌群在宿主植物中的組成和生態(tài)分布特征隨著組織類型、季節(jié)、降水量、溫度、宿主樹齡、光照和營養(yǎng)成分等眾多因素的改變而變化[31-34]，植物內(nèi)生真菌與宿主間是一種動態(tài)平衡的進(jìn)化過程，彼此發(fā)揮著重要的生態(tài)學(xué)功能。綜上所述，內(nèi)生真菌也產(chǎn)生具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，可為開發(fā)新的抗菌藥和化合物提供重要依據(jù)。

本研究對111株內(nèi)生真菌進(jìn)行抑菌活性測試，獲得具有較高活性、對多種病原真菌具有抑制作用的RJ-1和JJ-1菌株，分別鑒定為橡膠生擬莖點霉(Phomopsisheveicola)和新殼梭孢菌(Neofusicoccumparvum)，具有一定的潛在生防應(yīng)用價值。已有研究表明，橡膠生擬莖點霉(Phomopsisheveicola)和新殼梭孢菌是橡膠幼樹和柏木枯萎病的病原真菌[35-36]，而在本研究中屬于內(nèi)生真菌，通過回接到健康腫節(jié)風(fēng)的不同組織，未出現(xiàn)致病現(xiàn)象，與Aly等[31]研究報道內(nèi)生真菌寄生到健康植物上受到環(huán)境脅迫時會引起植物發(fā)病而變成病原菌、內(nèi)生真菌與宿主植物呈動態(tài)平衡拮抗關(guān)系的觀點不一致，有待對病原菌與內(nèi)生真菌的轉(zhuǎn)換關(guān)系進(jìn)行探究后才能明確原因。RJ-1和JJ-1菌株的抗菌活性物質(zhì)代謝產(chǎn)物、發(fā)酵工藝優(yōu)化及其對植物生長的影響也需進(jìn)行系統(tǒng)探討。

4 結(jié) 論

腫節(jié)風(fēng)存在豐富的內(nèi)生真菌物種，從中篩選出的RJ-1和JJ-1菌株對15種病原真菌具有較強的抑制作用，可作為抗菌活性菌株開展深入研究。