豬藍耳病活疫苗中豬瘟外源病毒檢測

袁建琴 高斌戰 宋寶敏 孔艷彪 張 卓 周小霞

1.山西農業大學生命科學學院，山西太谷 030801；2.山西省獸用生物制品試驗推廣中心，山西太谷 030800

豬藍耳病，又稱豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PPRS），是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起的[1-4]。該病是一種接觸性傳染病，具有發病率和死亡率高以及發病急等特點，同時也能夠引起免疫抑制從而引發豬多種其他疾病[1]。PRRS 能夠造成懷孕母豬繁殖方面的障礙，如流產、木乃伊胎、死胎以及弱仔等，病豬出現嚴重的呼吸困難和呼吸急促[2,5-10]。為了防控該疾病，目前主要的手段是依賴于疫苗[11-13]。但在我國豬用疫苗中，外源病毒污染情況經常發生，這將直接影響到疫苗的安全性。間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）是先用一抗與待檢測的樣品反應，用PBS 洗去未與樣品結合的一抗，再用二抗與樣品和一抗的復合物反應，再洗去未結合的二抗，然后在熒光倒置顯微鏡下觀察染色結果；在熒光顯微鏡下，發光的位置表示了待測物質存在的部位；發光的強度表示了待測物質含量的多少；不同顏色的發光可以表示不同的待測物質[14]。這種方法價格低廉，操作簡單[15]。PK-15 細胞是豬腎細胞，其細胞系對豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV） 等一些豬源病毒都特別敏感。CSFV 在疫苗中的污染被認為是PPRS 疫苗污染的途徑之一，去除疫苗毒種中CSFV 的污染是生產合格疫苗的前提。本試驗通過IFA 檢測PRRS 活疫苗的安全性，有助于對疫苗中污染CSFV 等外源病毒污染危害的控制。

1 材料與方法

1.1 病 毒

未被CSFV 污染的PRRSV（已被相應的特異性抗血清中和）、CSFV、豬圓環病毒2 型（porcine circo virus 2 type，PCV-2），均由山西隆克爾生物制藥有限公司提供。

1.2 細 胞

PK-15 細胞由山西隆克爾生物制藥有限公司提供。

1.3 疫 苗

試驗使用2 批PRRS 活疫苗，批次分別為201901001、201901002，由山西隆克爾生物制藥有限公司生產。

1.4 主要試劑

MEM 培養液，購自北京北方同正生物技術發展有限公司；PBS 磷酸緩沖液（pH 值為7.2），購自北京博奧拓達（Biotopped）科技有限公司；新生牛血清，由濟南勁牛生物材料有限公司生產；CSFV 間接免疫熒光染色檢測試劑盒，購自中國獸醫藥品監察所；特異性抗血清，由山西隆克爾生物制藥有限公司提供。

1.5 主要儀器

超凈工作臺（型號為BCM-1000A），由江蘇蘇凈集團有限公司生產；二氧化碳培養箱（型號為HF90），購自上海力申科學儀器有限公司；研究級倒置顯微鏡（型號為OLYMPUS IX73），購自成貫儀器（上海）有限公司；生物安全柜（型號為BSC-1300ⅡA2），由蘇州安泰空氣技術有限公司生產。

1.6 方 法

1）PK-15 細胞的傳代與培養。準備好傳代所需要的所有器材，打開超凈工作臺中的紫外燈，在試驗前先照射30 min；從二氧化碳培養箱中取出1 瓶生長良好的PK-15 細胞培養瓶（培養面積75 cm2），用裝有75%乙醇的噴壺給手和培養瓶進行消毒；點燃酒精燈，倒掉原培養液，此過程及以下的各個步驟均要在酒精燈附近進行。

用PBS 液洗滌細胞培養瓶，洗掉細胞代謝廢物，倒掉PBS，重復2 次；加入1 mL 0.25%胰蛋白酶液（含EDTA），沿瓶壁緩緩轉動，使其充分接觸長有細胞的細胞培養瓶瓶壁；將培養瓶放入培養箱中，消化大約3 min，使細胞消化分離開來；將細胞培養瓶從細胞培養箱中取出來，然后倒掉胰酶，加入MEM 約10 mL，用帶洗耳球的移液管反復吹打（約30 次），將培養瓶壁上的細胞吹打下來，并將溶液中的細胞吹打開來；吹打完畢后，在培養瓶中留3 mL 細胞液，然后用MEM 加到約40 mL，再次吹打細胞和MEM 的混合液，使其混勻；將一部分液體倒入平板槽內，用排槍取槽內的混合液，以每孔100 μL 加入96 孔細胞培養板內，將鋪好細胞的培養板蓋好、封口，并做好標記；將含有剩余培養液的細胞培養瓶和鋪好的96 孔細胞培養板放到37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待3 d 后用于下一步的試驗。

2）接種。將隨機選擇的8 瓶（每批次4 瓶，2 個批次共8 瓶樣苗）待檢測的PRRS 疫苗從冰箱中取出，解凍、復蘇，在滅菌后的生物安全柜內用含3%新生牛血清的MEM 培養液在EP 管內進行適當稀釋，然后在小型振蕩器上震蕩混勻。每個EP 管用相應的特異性抗血清中和。

將稀釋后待檢測的樣品加入已長成良好單層的PK-15 細胞的96 孔細胞培養板（接毒前在倒置顯微鏡下先拍照并保存）對應的孔內，每瓶疫苗設置4 個復孔，每孔100 μL 液體；同時設置陽性對照（CSFV）和陰性對照（未被CSFV 污染的PRRSV）。注意與96 孔細胞培養板上先前標志的序號相對應，之后封口。將接種后的PK-15 細胞培養板放入37 ℃、5% CO2培養箱內培養，培養3 d 后用于免疫熒光檢測。

3）免疫檢測。使用CSFV 間接免疫熒光染色檢測試劑盒時，先要檢查內容物組分、保質期，用記號筆在盒子上標記開啟時間等信息；將試劑盒中的PBS 以1∶10 的工作濃度進行稀釋；取CSFV 間接免疫熒光染色檢測試劑盒中的一抗（CSFV 特異性抗體）于EP 管中，用PBS 以1∶300 的工作濃度進行稀釋；取CSFV 間接免疫熒光染色檢測試劑盒中的二抗（FITC 標記的兔抗豬IgG）于EP 管中，用PBS 以1∶500 的工作濃度進行稀釋；將稀釋后的一抗和二抗在振蕩器上充分攪拌均勻，避免反復凍融，4 ℃保存，盡快使用，二抗應在避光條件下使用。

取單層的待檢細胞，陰性對照和陽性對照在倒置顯微鏡下拍照并保存，后甩掉96 孔細胞培養板維持液，用PBS 洗滌2 次（每次洗滌時，每孔加入200 μL PBS，室溫條件下孵育5 min，要嚴格控制孵育的時間，不可隨便增加或減少，然后棄去PBS）；固定，每孔加入100 μL 80%冷丙酮溶液，4 ℃固定30 min，然后棄去丙酮，自然晾干；加一抗，用PBS洗滌細胞面1 次，然后每孔加入用PBS 適當稀釋后的CSFV 特異性抗體50 μL，37 ℃濕盒作用1 h；洗滌，甩掉里面的液體，每孔加入200 μL PBS。室溫下孵育5 min，棄去PBS，洗滌細胞面2 次；加二抗，每孔加入50 μL 用PBS 稀釋后的FITC 標記的兔抗豬IgG，37 ℃濕盒作用1 h；洗滌，甩掉里面的液體，每孔加入200 μL PBS。室溫下孵育5 min，甩掉PBS，洗滌2 次；觀察，在倒置顯微鏡下用藍色激發光（波長490 nm）觀察；采集照片，并進行分析。

4）特異性試驗檢測。將PCV-2 稀釋，加入到相應的96 孔細胞培養板內，培養3 d 后進行IFA 檢測。

5）重復性試驗。為了驗證此檢測方法的穩定性和重復性，保證結果的可靠性，再次培養PK-15 細胞，進行1.6 方法中1）、2）、3）、4）所述的相關操作與檢測。在不同時間（分別在3 周內進行試驗）、相同試驗條件下共重復3 次，所用的一抗和二抗是相同批次。

2 結果與分析

2.1 接毒前PK-15 細胞的形態觀察

PK-15 細胞鋪板培養3 d 后，在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態（圖1）。由圖1可見，細胞生長良好，細胞大小基本均一，形成致密單層，呈現較好的貼壁生長狀態，可用于下一步試驗。

圖1 正常的PK-15 細胞（40×）

2.2 接種病毒后熒光染色前觀察

接種病毒3 d 后，在熒光染色之前用在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態，接種用抗血清中和后的確定未被CSFV 污染的PRRSV 的陰性對照組PK-15細胞呈現出如圖2所示的形態。接種CSFV 的陽性對照組PK-15 細胞呈現出如圖3所示的形態。從圖中可以看出，陽性對照和陰性對照的細胞形態都沒有發生明顯變化，說明CSFV 不會使PK-15 細胞產生明顯的病變。

圖2 熒光染色前的陰性對照（40×）

圖3 熒光染色前的陽性對照（40×）

2.3 熒光染色后倒置顯微鏡下觀察

在形態學觀察后進行熒光染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察，根據視野下觀察到的黃綠色熒光的有無進行判定。在倒置熒光顯微鏡下，陽性對照的細胞孔內觀察到明顯的黃綠色熒光（圖4），陰性對照的細胞孔內沒有觀察到黃綠色熒光（圖5），說明試驗成功。待檢樣品的細胞孔內均未出現特異性黃綠色熒光（圖5），則2 批PRRS 疫苗都判為CSFV 樣品檢測陰性。

圖4 熒光染色后的陽性對照（20×）

圖5 熒光染色后的陰性對照（20×）

2.4 特異性試驗

PCV-2 接種的PK-15 細胞均未出現特異性黃綠色熒光（圖5），判為陰性，說明試劑盒特異性強，僅用于CSFV 的檢測。

2.5 重復性試驗

通過3 次重復的操作，最終的檢測結果一致（見圖1～圖5），說明本試驗方法可重復、穩定和可靠。

3 討 論

疫苗污染是許多疾病在豬群中傳播的重要途徑之一，養豬場通過使用污染了的活疫苗可能使陰性豬變為陽性豬，會給養豬場帶來嚴重的經濟損失，所以保證使用疫苗的安全性極其重要。運用免疫熒光技術檢測病毒抗原已經有20 多年[16]，本試驗運用IFA 檢測CSFV，與實驗室其他檢測方法相比，具有靈敏度高、直觀、經濟、特異、快速、簡單和可重復等優點，是對CSFV 進行檢測的良好方法[14]。而且，此方法在一般的實驗室均可進行，在熒光倒置顯微鏡下觀察檢測結果，更容易對結果進行判讀，因而被廣泛應用[14-15]。通常，用IFA 來檢測病毒抗原涉及很多影響因素，如抗體濃度、不同來源的血清、孵育時間、孵育溫度和固定劑的選擇等[17]，都可能會導致不同的試驗結果。在本研究中，PRRSV 對溫度和酸堿度都很敏感，很容易受到它們的影響[17]。因此在試驗時，必須設置嚴格的陽性對照、陰性對照以及特異性試驗，并在適宜的試驗條件下進行，從而保證試驗結果的準確、可靠和特異性。

一般來說，試驗的成功與原材料的選擇密不可分。PK-15 細胞對CSFV、PRRSV、PCV-2 都很敏感，是用來檢測和培養豬源性病毒的良好材料。在本研究中，培養的PK-15 細胞生長狀態良好，細胞邊緣清晰干凈，胞體透明（圖1），為試驗的成功打下了良好的基礎。

在形態學觀察時，研究發現陽性對照和陰性對照的PK-15 細胞形態沒有發生明顯變化，說明CSFV 不會使PK-15 細胞產生明顯的病變（如圖2和圖3所示）。形態學觀察和IFA 比較，形態學觀察靈敏度低，在病毒含量很少時，不易于觀察，所以本研究采用IFA 來進一步檢測CSFV。

此外，IFA 檢測細胞是胞漿著色，而核不著色。在免疫檢測過程中，如果有CSFV 抗原存在，就會和相應的一抗、被標記的二抗形成三者的復合物，細胞孔就會出現特異性胞漿內黃綠色熒光。本研究中，陽性對照孔細胞出現黃綠色熒光（圖4），陰性對照孔細胞和接種待檢疫苗的細胞孔均未出現特異性胞漿內黃綠色熒光，則都判為陰性（圖5），說明被檢測PRRS 疫苗均未被CSFV 污染。

本研究建立重復性試驗的目的是為了保證試驗結果的準確性和可靠性。一個具有說服力的檢測方法一定具有可重復性，在不同的時間、不同的地點、相同的試驗條件下都可以進行，最終得出相同的結果。本研究中，通過3 次重復的操作，在不同時間（分別在3 周內進行試驗）、相同試驗條件下最終的檢測結果一致，說明本檢測方法可重復、穩定和可靠。綜上所述，本研究建立的IFA 檢測PRRS 活疫苗中CSFV 的方法獲得了理想結果，陽性對照和陰性對照對比明顯，所有待檢2 批PRRS 活疫苗均沒有被CSFV 污染。

豬飲水不足損失大

首先，飲水不足會導致豬的腸道發病率增高。農村廣大農戶家庭養豬，多數采用傳統的水料一次性供給的飼喂方式，往往不管天氣條件、不分飼料種類，均不給飲水。豬由于飲水不足口渴后，特別是炎熱的夏季常出現喝臟水等現象，這種現象直接導致豬患多種腸道疾病。據統計，腸道疾病是近幾年來豬的多發性疾病，一般占豬發病總數的76%左右，而在這些腸道疾病中，有不少就是由于豬缺水喝臟水引起的。

其次，飲水不足會導致豬消化率降低，飼養成本提高。目前，農村大多采用圈養豬的飼養方式，每天只飼喂2～3 次水混料，水分供應極為不足。特別是育肥豬，飼養戶對育肥豬每天補飼大量的熱能飼料，而這些熱能飼料需要吸收大量的水分后才能被豬體消化吸收、輸送。飼養戶每天只飼喂2～3次后就把豬圈在狹小圈舍內，使豬形成腸燥熱，腸蠕動減緩，營養吸收不全，日食量逐漸減少，消化率降低，生長發育受阻等。經有關部門對20 戶養豬戶飼養的100 頭豬的抽樣調查表明，在飼喂1 h 后，口渴急需飲水的豬就有98 頭，占抽查總數的98%。同時，又以肥壯，喂精料、雜糠、米糠的豬口渴程度深，飲水量較大。