不同連作年限番茄根系淀積物的變化及其與根結線蟲的關系*

常海娜，王春蘭，朱 晨 ，王東升 ，李 榮， 周 星，龔 鑫， 陳小云， 胡 鋒， 劉滿強?

（1. 南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095；2. 江蘇省有機固體廢棄物資源化協同創新中心，南京 210095；3.南京市蔬菜科學研究所，南京 210042）

設施蔬菜栽培具有土地利用率高、生產周期短、受季節影響較小等優點，已成為我國公民蔬菜消費和農民收入的重要來源[1]。然而，由于設施蔬菜作物的連續單一種植、肥料投入量大以及設施環境相對封閉，造成與土壤相關的障礙問題日益突出，如土壤酸化和鹽漬化、土壤養分失衡、土傳病害頻發等[2-3]。尤其是根部病蟲害的發生直接影響了蔬菜的正常生長發育，其中，根結線蟲作為設施內普遍發生且危害嚴重的植物土傳病害之一，已成為限制設施蔬菜生產與可持續發展的重要障礙因子[4]。由于根際是植物和土壤的橋梁，能夠靈敏地反饋植物和土壤的健康狀況，并同時影響土壤和植物的健康。因此，聚焦根際過程中與根系直接相關的病原物，了解土壤健康尤其是土壤生物群落與植物健康的關系，逐漸受到越來越多的土壤學家的關注[5]。有關這方面的知識也會在減少農業化學品施用、保障食品安全及保護農業生態環境等綠色發展中發揮越來越重要的作用[6]。

根結線蟲是一類在蔬菜生產中普遍存在的植物寄生性線蟲，其寄主范圍廣，對茄科作物危害嚴重[7]。其二齡幼蟲僅感染根系，受害部位形成瘤狀根結，消耗植物的光合產物和養分，導致植株對其他病蟲害的抵抗力下降，最終造成巨大的經濟損失[8]。當前，連作過程中過量施用化肥進一步惡化了土壤環境[9]，同時也降低了作物對病蟲害的抗性，促進了根結線蟲病害的發生[10]。此外，根際釋放的有機物質影響著植物的根際環境，進一步反饋給根結線蟲并誘導其發生[11]。已有的研究表明，包括根結線蟲在內的地下食根動物對寄主的識別和感染依賴于一些根際信號物質，如酚酸類、黃酮類、糖類和生物堿類化合物等[12-13]。而根系淀積（rhizodeposition）作為植物向土壤生態系統輸入有機物的重要途徑之一，其根系淀積物伴隨連作年限的不斷延長也會誘發某些病原體的定殖和感染[14]，如連作條件下根系淀積物與根結線蟲的關系（圖1）。然而，由于傳統上不同學科的研究相對孤立，現有連作影響病蟲害的研究通常未整合根系淀積物等與根結線蟲的關系，限制了對連作條件下根結線蟲病害發生規律和機制的認識。

圖1 連作條件下根系淀積物與根結線蟲關系的概念思路框架（實線箭頭代表正面影響，虛線箭頭代表負面影響）Fig. 1 Conceptual framework showing the relationship between rhizodeposits and root-knot nematodes under continuous monocropping systems（Solid arrow represents positive impact and dotted arrow represents negative impact）

本研究基于番茄不同連作茬數的田間定位實驗，分析根結線蟲危害和根系淀積物組成的差異，探討土壤化學性質尤其是根系淀積物與根結線蟲的關系。研究結果可進一步加深對連作障礙條件下根結線蟲病的認識，為深入了解蔬菜連作中根結線蟲發生的微生態機制及研發蔬菜連作障礙修復措施和防控策略提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和預處理

不同連作茬數番茄的根系和土壤采自南京市蔬菜花卉科學研究所內的田間定位實驗田（118°46′36.87″ E，31°43′11.50″ N）。選擇具有同樣種植歷史（辣椒-番茄-菠菜輪作）的相鄰大棚（具有同樣的土壤基礎性質），分別從2013 年、2014 年和2016 年開始采用番茄連續單一種植制度，一年分春茬（3—7 月）和秋茬（8—12 月）番茄，在2016年秋茬番茄（分別為第2、6、8 茬）收獲前統一采樣。各棚內的施肥和灌溉措施保持一致。土壤類型為淋溶土，質地為黏壤土（黏粒 229 g·kg-1，粉粒365 g·kg-1，砂粒 406 g·kg-1）。土壤 pH 7.21（水），有機碳 18.2 g·kg-1，全氮 3.27 g·kg-1，全磷 3.58 g·kg-1，全鉀19.2 g·kg-1，礦質氮（銨態氮和硝態氮之和）140.5 mg·kg-1，有效磷 31.5 mg·kg-1，速效鉀 719 mg·kg-1。

供試作物為番茄（世紀紅冠），在番茄定植前兩天將有機肥（腐熟的雞糞75 t·hm-2）作為基肥一次性均勻翻施入耕層土壤中。于2016 年10 月21 日分別從第2、6、8 茬番茄棚中選擇有機肥處理的小區，每處理3 個小區，小區面積約為8 m2，每個小區隨機選取3 株番茄挖掘根系，共27 株。采用抖根法并用毛刷采集植株根際土壤，同一小區的土壤樣品均勻混合。植株用水洗凈后觀察其形態。部分土壤樣品置于液氮中快速冷凍并儲存于-80 ℃冰箱待進行化合物提取和氣相色譜-飛行時間質譜（GC/TOF-MS）分析，其余土壤預處理后用于土壤化學性質的測定。

1.2 根際土壤化合物的提取

通過改進 Yang 等[15]研究中樣品的提取方法，分別對不同連作茬數番茄根際土壤中的化學物質進行萃取和衍生化。化合物萃取：稱取1.0 g 根際土壤樣品置于離心管中，加入甲醇/氯仿（3︰1 v︰v）提取液和乙酸乙酯進行渦旋；再加入瓷珠，研磨并超聲（冰水浴），重復5 次；然后將樣本離心后小心移取上清液于離心管中。化合物衍生化：先于真空濃縮器中干燥提取物；再加入甲氧胺鹽試劑并輕輕混勻后放入烘箱中80 ℃培養30 min；然后向每個樣品中加入雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA），將混合物于70 ℃下培養1.5 h。冷卻至室溫，樣品采用氣相色譜儀（Agilent 7890，安捷倫科技有限公司）隨機順序上機檢測。

1.3 分析方法

土壤有機質采用外加熱重鉻酸鉀氧化—容量法測定；銨態氮和硝態氮采用 2 mol·L-1氯化鉀浸提后用流動分析儀（SKALAR San++，荷蘭）測定；可溶性有機碳采用超純水浸提后用總有機碳（TOC）分析儀（Elementar Vario EL III，德國）測定；土壤有效磷采用 NaHCO3浸提，鉬銻抗比色法測定[16]；土壤速效鉀采用 NH4OAc 浸提，火焰光度法測定；土壤pH 和電導率（EC）測定時水土比為5︰1。

番茄根結線蟲病情評估：根結指數=∑（各級病株數×各級代表值）×100/（調查總株數×最高嚴重度代表值）[17]。

氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀（Agilent 7890，安捷倫科技有限公司）配有Agilent Rxi-5MS 毛細管柱（30 m × 250 μm × 0.25 μm,美國）。GC/TOF-MS分析條件如下：進樣量為1 μL，分流比10∶1，載氣為氦氣，前進樣口吹掃流速為3 mL·min-1，柱流速為 1 mL·min-1，程序升溫（50 ℃保持 0.5 min，以 15 ℃·min-1的速率上升至 320 ℃，并保持10 min），前進樣口溫度為 280 ℃，傳輸線溫度為320 ℃；離子源溫度為230 ℃，電離電壓為-70 eV，質量范圍為50～500 m·z-1，掃描速率為10 s-1，溶劑延遲時間為4 min。

1.4 數據分析

使用 MS-DIAL 軟件對質譜原始數據進行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分和峰對齊等分析[18]；使用Fiehn Binbase 數據庫對物質定性[19]，選用匹配度大于700、保留時間偏差（RI）小于5%的化合物[20]。將化合物的原始數據上傳至MetaboAnalyst 4.0 進行標準化：中值歸一化、對數轉換和自動數據縮放[21]。在軟件 R 3.3.2 中對已鑒定化合物進行非度量多維尺度分析（NMDS），可以直觀地體現不同連作茬數番茄之間化合物的差異；然后進行偏最小二乘法判別分析和t檢驗，根據變量投影重要性值（閾值大于1.2）和t檢驗的P值（P＜0.05）來確定差異性表達的化合物[22]。用Statistics 7.1 統計軟件對數據進行分析，采用單因素方差分析并用最小顯著差異（LSD）法進行處理之間的差異顯著性檢驗（P＜0.05）。使用R 軟件對化合物組成及根結指數進行斯皮爾曼（Spearman）相關性分析，并用 Gephi 0.9.2 軟件和Fruchterman Reingold 算法分別對不同連作茬數番茄的根系淀積物組分與土壤化學性質和根結指數的相關性結果進行網絡可視化。

2 結 果

2.1 連作茬數對根際土壤化學性質的影響

連作茬數顯著影響了根際土壤養分含量。與連作2 茬相比，連作8 茬后土壤銨態氮（）和溶解性有機碳（DOC）含量分別下降了 4.31%和15.07%，差異顯著；隨著連作茬數的增加，土壤有機碳（SOC）含量顯著升高，硝態氮（）含量先升高后降低。此外，土壤 pH 隨著連作茬數的增加而降低（表1）。

2.2 連作茬數對番茄根系形態的影響

隨著連作茬數的增加，側根和須根上的根結數越來越多，并連接成串珠狀，造成根系腫脹、畸形，在連作8 茬番茄中表現最為嚴重；相應地，番茄的根結指數隨著連作茬數的增加而增大（圖2）。

表1 不同連作茬數番茄根際土壤化學性質Table 1 Chemical properties of the rhizosphere of monocropping tomato relative to history of monocropping

圖2 不同連作茬數下的番茄根系形態Fig. 2 Morphology of tomato roots relative to history of monocropping

2.3 連作茬數對番茄根系淀積物的影響

從番茄根際土壤中共鑒定出 150 種化合物，連作茬數對這些化合物的組分及相對含量有顯著影響，且差異隨著連作茬數的增加而增大（圖 3）。根系淀積物主要包括醇類、有機酸類、氨基酸類、糖類、萜類、生物堿和甾族化合物等。其中有機酸類化合物的數量最多、相對含量最高，且在第 6 茬和第8 茬中有機酸種類（51 種和52 種）顯著多于第2茬（46 種）；在第 2 茬處理中未檢測到生物堿類物質，但其相對含量在第6 茬和第8 茬中較高，分別為8.96%和9.33%（表2）。

圖3 不同連作茬數番茄根際土壤中化合物的非度量多維尺度分析（NMDS）Fig. 3 Nonmetric multidimensional scaling（NMDS）plot of the compounds in the rhizosphere of the tomato relative to history of monocropping

2.4 不同連作茬數番茄根際差異化合物種類的變化

在偏最小二乘法判別分析中，變量投影重要性值大于1.2 的候選差異化合物有25 種，結合t檢驗確定了在不同連作茬數間具有顯著差異（P＜0.05）的11 種化合物。其中，D-半乳糖、L-蘋果酸和草酸等化合物在第2 茬中有較高水平，而間羥基苯丙酸、百里香酚、月桂酸、水楊酸、琥珀酸和顛茄堿等在第6 茬和第8 茬中的水平顯著高于第2 茬（圖4）。

2.5 不同連作茬數番茄根系淀積物、土壤化學性質和根結指數的共現網絡結構

第2 茬的網絡連接度最高（平均度為9.484），平均路徑長度（5.744）和網絡直徑（18）最小，隨著連作茬數的增加，網絡連通度降低，表明連作降低了網絡的復雜性；與第 2 茬相比，第 6 和第 8 茬網絡中的節點數增加，化合物種類增多；各網絡均達到了模塊化程度（模塊化指數大于0.44），連作增加了網絡的模塊化系數，表明網絡的內部形成不同模塊的可能性增加（表3，圖5a））。其中，差異化合物與土壤化學性質和根結指數的關系比較密切，與土壤pH 呈負相關的是間羥基苯丙酸、水楊酸和琥珀酸；與含量呈正相關是間羥基苯丙酸、水楊酸和顛茄堿；與AP 含量呈負相關的是麥角甾醇。此外，代表根結指數的節點隨著連作茬數的增加其與其他化合物的相關性明顯增大，在第 2 和第 6 茬中與月桂酸含量呈正相關；在第 8 茬中與月桂酸含量呈負相關，與土壤含量以及顛茄堿和麥角甾醇的含量呈正相關（圖 5b））。

表2 不同連作茬數下根系淀積物的組分及相對含量Table 2 Composition and relative contents of its components in the rhizodeposits relative to history of monocropping

圖4 不同連作茬數番茄根際差異化合物的變量投影重要性預測值分布Fig. 4 Distribution of predictions of importance of variable projections of differential compounds in the tomato rhizosphere relative to history of monocropping

3 討 論

3.1 連作對土壤理化性質、根系淀積物和根結線蟲病情的影響

番茄連茬種植后土壤 pH 下降，而硝態氮含量升高，一方面因為長期高強度單作從土壤中選擇性地吸收較多的堿基元素和中微量元素，導致土壤向酸化方向發展[23]；另一方面，棚內施肥量和蒸發量較大，導致土壤中硝酸鹽累積及土壤表層的次生鹽漬化[24]。連作對番茄根系淀積物的組分及其相對含量有顯著影響，其中，有機酸類物質的數量和相對含量伴隨連作茬數的增加而增加（表 2），而多數有機酸類物質被認為是化感物質或自毒物質，當其積累到一定水平，能直接影響自身或周圍植株的生長，這是導致作物發生連作障礙的重要原因之一[25]。此外，連作茬數的增加導致番茄根結指數增大，這表明根結線

蟲病情隨著連作時間的延長而不斷加劇[26]。主要是因為在設施栽培條件下，連茬種植不僅導致根系淀積物中自毒物質的積累，而且伴隨著根際土壤生物群落結構和多樣性的破壞，如土壤中有益生物減少而有害病原物增多，抑制植株生長并降低其抗性，促使根結線蟲等土傳病害發生[27]。同時，連茬種植改變了根際土壤的線蟲群落結構，使根結線蟲成為優勢種群，且土壤中病蟲基數不斷增大，致使根結線蟲病害持續流行并逐年加重[28]。此外，由于連茬種植同種作物，根系向根際反復釋放相似的組分，不僅改變了根際土壤環境，還可能誘發根結線蟲的發生[29]。

表3 不同連作茬數番茄網絡拓撲結構指標Table 3 Network topology structure indices of the tomato relative to history of monocropping

圖5 不同連作茬數番茄的根系淀積物、土壤化學性質和根結指數的共現網絡a）根系淀積物中的所有化合物，b）根系淀積物中的差異化合物Fig. 5 Network co-occurrence analysis of rhizodeposits，soil chemical properties and root-knot index relative to history of monocropping a）All compounds in rhizodeposits，and b）Differential compounds in rhizodeposits

3.2 連作茬數影響下根系淀積物與根結線蟲的關系

根際是根結線蟲的主要活動空間，根際土壤環境的變化特別是根系淀積物中化合物組分及含量的變化密切聯系著根結線蟲的生存及活動[11]。本研究發現番茄根系淀積物中的有機酸類物質，如間羥基苯丙酸、水楊酸、百里香酚、琥珀酸、月桂酸等的相對含量隨著連作茬數的增加而不斷升高（圖4）。其中，間羥基苯丙酸和水楊酸等酚酸類化合物被認為是土壤和植物根系分泌物中普遍存在的化感物質[30]，琥珀酸對番茄青枯病有正趨化作用[31]，這些物質在根際中隨著連作茬數的增加而不斷積累，間接降低了植株抵抗病蟲害的能力，從而有利于根結線蟲的成功侵染。有研究表明，水楊酸能合成水楊酸甲酯，這種物質有助于根結線蟲二齡幼蟲（J2）對宿主的識別行為[32]。此外，有研究證明根際中的月桂酸在低濃度（0.5～2.0 mmol·L-1）時能吸引根結線蟲并使其致死，高濃度（4.0 mmol·L-1）時能直接趨避根結線蟲[33]；百里香酚作為一種天然殺菌劑對根結線蟲的二齡幼蟲也有致死作用[34]。根際中這些抗性物質的相對含量隨著連作茬數的增加而增加，說明植株根系受到根結線蟲侵染后會分泌一些特異性物質來啟動自身的防御機制[35]，而這些化合物對今后開發根結線蟲的新型控制策略具有潛在的利用價值。

研究結果發現連作茬數增加后，根系淀積物中化合物的種類增多，但由土壤化學性質、根系淀積物和根結指數構成的網絡結構圖的整體復雜程度略有降低，模塊化程度增加（圖5），說明連作導致了根際土壤中化合物的不均衡累積。隨著連作茬數的增加，與土壤化學性質和根結指數間關系密切的化合物組分相應改變，表現為網絡中節點的連接度越大，與其相連組分間的關系越強[36]。網絡中與根結指數關系較強的節點隨著連作茬數的增加而增多。其中，月桂酸在低茬番茄中與根結指數呈正相關，在連作8 茬時與根結指數呈負相關，而月桂酸含量隨著連作茬數的增加而升高，符合前人報道的月桂酸對根結線蟲調控的濃度效應[33]。在連作8 茬中，根結指數還與根系淀積物中顛茄堿和麥角甾醇的含量呈正相關，說明連茬種植后根際中顛茄堿和麥角甾醇含量的增加可能對根結線蟲有正趨化作用，然而這些物質與根結線蟲的功能關系尚未見報道。今后進一步的研究可通過分離純化或合成等途徑以揭示特定的化合物在根結線蟲-宿主關系中的作用。

此外，連作條件下番茄根系淀積物的變化與土壤化學性質之間的聯系也可影響根結線蟲的發生。本研究發現間羥基苯丙酸、水楊酸等有機酸類物質的相對含量與土壤pH 呈負相關，與含量呈正相關（圖5b））。以往的研究主要關注土壤pH 的總體變化，較少地考慮根系淀積物豐富的有機酸類化合物如對羥基苯甲酸、肉桂酸、苯甲酸等的積累是作物連茬種植后土壤 pH 下降的重要原因[37]。同時，土壤酸化又是促進根結線蟲發生的重要因素[38]。因此，深入揭示連作對作物病害的影響機制需要同時考慮多種因素的ss 綜合作用，今后需要結合多種技術和研究途徑才能系統地理解和揭示連作障礙的成因和對策。

4 結 論

伴隨著連作年限的增加，番茄根結線蟲病情加劇，根際土壤趨于酸化；且根系淀積物中的化合物種類及含量也相應地改變，如間羥基苯丙酸、百里香酚、月桂酸、水楊酸、顛茄堿和麥角甾醇等差異化合物不斷累積，并與土壤化學性質、根結指數之間存在密切聯系。連作條件下作物根系淀積物的累積與土壤非生物因素的共同作用加重了根結線蟲病害的發生。今后應在篩選關鍵差異化合物的基礎上，通過成分模擬明確根際特殊化合物的功能作用及與生物和非生物因素綜合作用對根結線蟲發生的影響機制。

致 謝感謝南京農業大學植物保護學院李紅梅教授在實驗上的指導，資源與環境科學學院周陽和張宇同學的幫助。