蘿卜抽薹時間的QTLs定位及分析

曲麗君，張見，邢軍，李欣屹

(天津天豐澤田生物科技有限公司，天津 300457)

抽薹是植物從葉叢中抽出花薹的現象，是植株由營養生長向生殖生長轉化的關鍵時期，是植物在長期的進化過程中形成的特性[1-2]。由于植物物種及其產品器官的多樣性，對于食用花莖、花蕾和角果的作物來說，適當促進抽薹開花是重要的。而對于以變態根和變態莖為產品器官的作物來說，抽薹會導致產品器官品質下降。蘿卜是世界上重要的蔬菜作物，其產品器官為肉質根，不僅具有豐富的營養價值，而且具有較高的藥用價值。蘿卜先期抽薹指肉質根在完全膨大之前就已抽薹開花[3]。先期抽薹導致植株進入花芽分化狀態，肉質根膨大基本停止，且隨著花芽分化、抽薹和開花，肉質根由致密變為疏松，品質快速下降, 失去商品價值[4]。

關于抽薹性狀的遺傳規律在甘藍、青花菜、大白菜等十字花科蔬菜中已取得重要進展。Kagawa[5]對大白菜的研究認為，早抽薹對晚抽薹為顯性。Baggett等[6]研究青花菜和甘藍的雜交組合，發現抽薹是數量性狀遺傳。張韜[7]認為，抽薹性狀是由多基因控制的數量性狀，但是早抽薹性狀對晚抽薹性狀并不是完全顯性，易受環境的影響且遺傳效力較低。一些控制甘藍和大白菜抽薹性狀的QTLs位點被挖掘。陳書霞等[8]利用F2群體構建了甘藍類RAPD標記遺傳圖譜，并定位了同抽薹期相關的3個QTLs，分別位于第1、3和8號連鎖群上。李梅[9]以結球甘藍品種間雜交獲得的F2群體作為構圖群體，構建了甘藍分子遺傳圖譜，并對結球甘藍抽薹時間性狀進行QTLs定位，最終獲得1個與抽薹時間相關的QTL，可解釋18.7%的表型變異。Kitamoto等[10]在經過春化的大白菜F2群體中將控制抽薹時間的QTLs定位于2、3和5號連鎖群，其中位于2號連鎖群的QTL對抽薹性狀的貢獻率達到46.0%，解釋的表型變異最大。目前關于蘿卜抽薹性狀遺傳規律的報道較少。Kaneko等[11]在蘿卜異源染色單體中發現了1個早抽薹基因，它對于控制栽培種晚抽薹性狀的幾個基因均為顯性。趙麗萍[4]利用主基因與多基因混合遺傳模型聯合分析方法對蘿卜抽薹性狀進行遺傳分析，發現蘿卜抽薹性狀符合兩對主基因+多基因遺傳模型。這與其他十字花科蔬菜抽薹性狀的遺傳規律基本一致。

本研究中以早抽薹材料YS105和晚抽薹材料ZP85為親本構建F2群體，同時借助SSR多態性標記構建的蘿卜分子遺傳圖譜，進行蘿卜抽薹時間的QTLs定位及分析，可為培育耐抽薹蘿卜新品種及分子輔助育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以蘿卜野生材料YS105為母本，栽培型材料ZP85為父本配制F1，F1嚴格自交獲得F2群體。其中YS105為早抽薹材料，ZP85為晚抽薹材料。F2群體大小為342株。采取常規方法進行栽培管理。

1.2 抽薹性狀調查及分級

自播種至花薹伸長至3～5 cm所需的天數作為抽薹時間。對親本、F1和F2群體分單株進行連續調查并記錄抽薹時間，直至栽培型材料ZP85肉質根成熟終止調查(播種后75 d)。根據各單株抽薹所需天數參照以下標準對其抽薹性進行分級：1級，抽薹天數≤45 d；2級，45 d<抽薹天數≤55 d；3級，55 d<抽薹天數≤65 d；4級，65 d<抽薹天數≤75 d；5級，抽薹天數>75 d。

1.3 DNA提取和分子標記

DNA的提取采用改良的CTAB法[12]。其中親本和F1的DNA用于多態性SSR標記篩選，F2群體的DNA用于構建遺傳圖譜和QTL定位。

本文所用的SSR分子標記來源于蘿卜基因組序列，根據蘿卜EST序列設計的SSR引物[13]以及參照 Hashida 等[14]。PCR反應體系15 μL：2 μL DNA(40 ng·μL-1)，正向、反向引物(10 ng·μL-1)各0.25 μL，Taq酶 0.2 μL(2.5 U·μL-1)，dNTP 0.2 μL，Mg2+1.2 μL(25 mmol·L-1)，10×Taqbuffer 1.5 μL，ddH2O 9.4 μL。PCR 反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環；72 ℃保溫8 min。擴增產物用8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠，160 V恒功率電泳分離1 h，銀染顯色后在膠片觀察燈下進行帶型統計分析。SSR引物序列由上海生工生物技術公司合成。

1.4 遺傳圖譜的構建

利用親本篩選多態性SSR分子標記對F2群體DNA進行分析。按照JoinMap 4.0軟件[15]要求的方法統計條帶：與父本YS105一致的帶型記為a，與母本ZP85一致的帶型記為b，雜合的帶型記為h，未擴增出的或模糊不清的帶型記為u。采用JoinMap 4.0軟件作圖，利用Kosambi作圖將重組交換率轉化為centi-Morgans (cM)[16]。

1.5 QTLs定位

利用MapQTL4.0軟件[17]進行QTLs分析，首先利用置換測驗1 000 次重復，根據“Permutation test”進行全基因組掃描，估算基因組范圍內α=0.05水平上的LOD閾值。然后，利用區間作圖法(interval mapping，IM)進行QTL分析，得到大于LOD閾值的QTL位點。對于IM分析得到的QTL，將最高LOD 值所在位置的標記或與其緊密連鎖的標記作為協同因子，再對IM檢測到的QTL進行多座位QTL模型(MQM)檢測，作為最終的定位結果。以連鎖群上LOD值最高的位置作為QTL的位置，同時分析每個QTL對蘿卜抽薹性狀的遺傳參數和貢獻率。QTL的命名規則如下：斜體字母“q”+性狀的英文縮寫+連鎖群號+QTL編號[18]。如qbt-1-1即表示位于第1連鎖群上第一個與抽薹時間(bolting time，bt) 相關的QTL。

1.6 數據統計及分析

利用 SPSS13.0 統計軟件對雙親、F1及F2群體各單株的抽薹級數的調查結果進行統計分析并獲得其表型變異及分布。

2 結果與分析

2.1 蘿卜抽薹時間的表型變異

通過對植株抽薹時間的數據進行分析，發現母本YS105的平均抽薹時間為42 d，抽薹分級為1級，而父本ZP85在調查結束時(75 d)均沒有植株發生抽薹，抽薹分級為5級。F1的平均抽薹時間為68 d，抽薹分級為4級，介于雙親之間。F2群體在調查結束時有119株仍沒有發生抽薹，抽薹分級為5級，其他224株植株的抽薹時間變化幅度為32～75 d, 抽薹分級為1～4級(圖1)。由此可見，蘿卜抽薹時間性狀在F2群體中的分布基本介于雙親之間，少部分植株在該性狀中出現了超親分離現象。

圖1 蘿卜F2群體抽薹時間分級的分布

2.2 SSR 遺傳圖譜構建

利用親本和F1篩選到的114對多態性SSR標記對包含342個單株的F2群體進行鑒定。利用JoinMap 4.0[17]建立了包含9個連鎖群的蘿卜遺傳圖譜。該圖譜覆蓋基因組長度894.9 cM，平均標記間距為7.85 cM。連鎖群的長度在50.8～155.4 cM。每個連鎖群的標記數在6～20，其中LG1和LG4包含的標記數最多，為20個，LG5和LG9含有的標記數最少，僅有5個(圖2)。

圖2 蘿卜抽薹時間遺傳圖譜及QTL定位

2.3 抽薹時間性狀的QTLs定位

經“Permutation test”對全基因組掃描，估算“Rel.cum.count”為0.950 0時的Interval值為3.3，即設定當LOD值≥3.3時存在QTL。利用區間作圖法并結合多座位QTL模型(MQM)檢測，共檢測到4個與蘿卜抽薹時間相關的QTLs，分布于LG 5、LG 6、LG 8和LG 9上，分別命名為qbt-5-1、qbt-6-1、qbt-8-1和qbt-9-1 (圖2、表1)。LOD值介于10.18～18.11，可解釋8.4%～21.6%的表型變異率。

qbt-5-1的LOD值為10.18，介于標記RSS2108～RS5-3，貢獻率為8.4%，加性效應為0.47，顯性效應為0.20；qbt-6-1位于89_21540～89_21637，其LOD值為18.11，可解釋14.7%的表性變異率，其加性效應為0.67，顯性效應為-0.48；qbt-8-1介于41_14295～RS8-2，LOD值為16.69，可解釋21.6%的表型變異率，該位點的加性效應為0.81，顯性效應為0.06；qbt-9-1位于標記9ssr-10～9ssr-14，LOD值為11.57，貢獻率為10.7%，加性效應為0.57，顯性效應為0.13。

表1 蘿卜抽薹時間QTLs定位及效應分析

3 討論

蘿卜抽薹性狀為主基因和多基因控制的數量性狀，易受環境條件影響，人為難以控制，且早抽薹對晚抽薹為不完全顯性，因此，給選育耐抽薹品種及新種質資源開發帶來較大困難[4,11]。分子圖譜構建及QTLs定位可加速分子標記輔助育種的進程。本研究利用 F2群體對控制蘿卜抽薹時間性狀的QTLs進行定位及效應分析，最終得到與蘿卜抽薹時間相關的4個QTLs位點(qbt-5-1、qbt-6-1、qbt-8-1和qbt-9-1)，分別位于蘿卜第5、6、8和9連鎖群上。它們的遺傳貢獻率分別為8.4%、14.7%、21.6%和10.7%，加性效應分別為0.47、0.67、0.81和0.57，顯性效應分別為0.20、-0.48、0.06和0.13。這4個位點均為增效位點，可在低世代育種中快速選擇純合的優良性狀。qbt-8-1貢獻率達到21.6%，可能是控制蘿卜抽薹時間的主效位點。

一些與抽薹性狀相關的連鎖標記的開發利用可大大加速耐抽薹品種的改良進程。Ajisaka等[19]利用BSA策略獲得了一個與大白菜極晚抽薹性狀緊密連鎖的RAPD標記RA1255C，并成功轉化為共顯性RFLP標記，該QTL可解釋77%的表型變異，為晚抽薹的分子標記輔助選擇奠定了重要基礎。目前對蘿卜抽薹分子標記的研究還相對較少，存在遺傳距離較大，尚不能較好地用于分子標記輔助育種的問題。趙麗萍[4]采用BSA與GRA策略，對抽薹性狀進行多種遺傳標記分析，獲得可能與抽薹性主效位點緊密連鎖的8個標記。徐文玲等[20]利用AFLP分子標記技術，結合BSA法，獲得2個與蘿卜耐抽薹基因連鎖的標記，其遺傳距離分別為14.6和9.1 cM。在本文中，我們將3個QTLs位點(qbt-5-1、qbt-6-1和qbt-9-1)的遺傳距離控制在11.1 cM以內，下一步將繼續在該區域附近設計引物進行加密，將蘿卜抽薹性的基因控制在更小的距離范圍內，力求獲得與蘿卜抽薹性更為連鎖的分子標記，用于蘿卜耐抽薹品種選育過程。