甲魚蛋白肽的抗腫瘤作用及其對微管蛋白聚合-解聚的影響

馬遜斌，樓博，何晨怡，王楠*，王偉

(1.浙江樹人大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州 310015； 2.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021)

癌癥是嚴重危害人類健康的重大疾病。從天然動、植物中尋找高效的抗癌活性物質已成為近年來的研究熱點。抗腫瘤肽具有分子質量小、極易穿透癌細胞、穩定性較強等特點，可以通過提高免疫應答、抑制腫瘤血管形成等抑制腫瘤生長和轉移[1]，根據作用機制分為受體干擾肽、蛋白間抑制肽、酶抑制肽和核酸間作用肽[2]。微管是真核細胞中重要的結構組分，由α和β微管蛋白異二聚體裝配成長管狀纖維結構[3]，作為細胞結構的組成部分參與多種細胞器的組成，在細胞分裂的有絲分裂期，微管蛋白起著決定性的作用[4]。已有研究發現，很多化合物能與微管蛋白結合，通過干擾微管的動力學行為，達到抑制微管正常功能的目的，導致有絲分裂障礙，誘導腫瘤細胞凋亡[5-7]，抑制微管功能已成為重要的發現抗腫瘤化合物的策略。

甲魚又稱鱉、潭魚、嘉魚、水魚，是一種珍貴的水生經濟動物。甲魚肉質鮮嫩，含有豐富的蛋白質、礦物質元素及不飽和脂肪酸，具有強身健體、提高免疫、延年益壽、防癌抗癌的功效，是藥食同源佳品[8-11]。本研究以甲魚為原料制備甲魚蛋白肽，并研究甲魚蛋白肽對微管蛋白聚合-解聚的影響，為抗腫瘤活性肽的開發提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

甲魚購自農貿市場，4-嗎啉乙磺酸(MES)購自北京沃凱生物科技有限公司，EGTA、ATP、GTP、分離膠、濃縮膠、福林酚購自北京索萊寶科技有限公司，牛血清白蛋白購自SIGMA-ALDRICH公司，MgCl2、丙三醇、鹽酸、無水碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、甲醇、冰醋酸購自國藥集團化學試劑有限公司，考馬斯亮藍R250購自白鯊生物科技，過硫酸銨購自廈門海標科技有限公司，四甲基乙二胺購自福州飛凈生物科技有限公司，蛋白上樣緩沖液購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.1.2 儀器

臺式高速冷凍離心機，德國賀利氏公司；數顯恒溫水浴鍋，常州市金壇友聯儀器研究所；UV-124紫外可見分光光度計，島津(中國)有限公司；XW-80A漩渦混勻機，上海精科實業有限公司；電泳儀、凝膠成像儀，美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 甲魚蛋白肽制備

甲魚宰殺→去脂→脫殼→打漿→凍干→中性蛋白酶酶解4 h→滅酶(100 ℃，10 min)→離心過濾(4 000 r·min-1，10 min)→取上清液→冷凍干燥→保存，備用[12]。

1.2.2 MTT法檢測甲魚蛋白肽對腫瘤細胞增殖的影響

取對數期的人肝癌細胞株HEPG2細胞，用質量分數0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基稀釋，制備1×105cell·mL-1的細胞懸液。將細胞懸液每孔100 μL接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的孵箱內培養24 h，待細胞貼壁后棄培養液，加入100 μL不同質量濃度的待測樣品(6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1)。同時設立空白組(只加培養液)和對照組(只加細胞和培養液)，每組設3個平行孔，繼續培養72 h后，每孔加入20 μL的5 mg·mL-1MTT溶液，孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，15 min后用酶標儀在波長490 nm處測定其吸光度值(D490)[13]，計算細胞增殖抑制率，并用多元回歸法計算半數抑制濃度(IC50)。

1.2.3 微管蛋白的分離與純化

參照Landino等[14]方法進行豬腦微管蛋白提取。把新鮮的成年豬腦置于冰水中，浸泡一段時間后，去除腦膜、大血管，用預冷的MES緩沖液清洗，制成勻漿。將腦組織勻漿4 ℃ 10 000 r·min-1離心1 h，提取上清液，加入相同體積的MES聚合緩沖液，37 ℃水浴30 min，輕微搖晃數次，26 ℃ 10 000 r·min-1離心1 h，去除上清，用MES緩沖液預冷卻，冰水浴30 min至沉淀物基本溶解，然后將溶液在高溫和低溫下各離心1次，離心得到的沉淀用少量MES緩沖液溶解在冰水浴中，得到微管蛋白溶液。

1.2.4 微管蛋白含量測定

參考李榮貞等[15]方法測定微管蛋白含量。

1.2.5 微管蛋白的鑒定

用質量分數為12%的分離膠(pH 8.8)、5%的濃縮膠(pH 6.7)進行SDS-PAGE電泳，0.05%考馬斯亮藍R250染色并觀察。

1.2.6 微管蛋白聚合和解聚動態平衡反應

在冰浴的比色皿中加入已純化的微管蛋白195 μL，然后加入ATP 5 μL，使其終濃度為1 mmol·L-1。在4 ℃、350 nm處迅速調零，置于37 ℃水浴中恒溫，每隔3 min取出測定吸光度D350，根據所測得的吸光度的變化繪制微管蛋白聚合曲線。當聚合曲線逐漸上升進入穩定高平臺期時說明微管蛋白聚合反應趨于平衡，待聚合反應基本結束后，將比色杯放入冰水中冰浴20 min，在此期間每間隔3 min測定D350，當解聚曲線逐漸下降并進入低平臺期后，解聚反應基本結束。

1.2.7 甲魚蛋白肽對微管蛋白聚合-解聚活性的影響

在上述微管蛋白聚合-解聚的反應系統中，實驗組加入不同濃度的甲魚蛋白肽(5 μL)，使其終濃度分別為0.5、0.75、1.5 mg·mL-1，按1.2.6節的測定方法記錄D350的變化。

1.2.8 結果評價

抑制率=100%(對照組D350-實驗組D350)/對照組D350。

2 結果與分析

2.1 甲魚蛋白肽對腫瘤的抑制活性

以不同濃度的甲魚蛋白肽(6.25～100 μg·mL-1)處理人肝癌HEPG2細胞72 h，設空白和對照，結果如圖1。與對照組相比，在各濃度觀察點甲魚蛋白肽均有顯著的抑制作用(P<0.05)，有效濃度為6.25～100 μg·mL-1，并呈良好的量效關系，半抑制濃度(IC50)為228.49 μg·mL-1。

圖1 甲魚蛋白肽對HEPG2細胞增殖的劑量依賴抑制效應

2.2 微管蛋白含量的測定與鑒定

按Lowry法[15]測定總蛋白濃度為13.95 g·L-1，經SDS-PAGE電泳結果顯示，總蛋白樣品中主要組分的相對分子質量介于45.0×103～66.2×103，與文獻所報道相符[16]，因此，圖2中出現的蛋白條帶即為本實驗所需的微管蛋白。

圖2 豬腦微管蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.3 微管蛋白聚合和解聚動態平衡反應

微管蛋白在37 ℃條件下聚合(0～10 min)，在4 ℃條件下解聚(40～60 min)，平臺期反應了微管蛋白在聚合條件下聚合-解聚之間的動態平衡(圖3)。微管蛋白在正常的生理條件下處于聚合-解聚動態平衡中，從而在細胞形態結構、細胞分裂和運動中起著重要作用。

圖3 微管蛋白在37 ℃時的聚合與4 ℃時的解聚曲線

2.4 甲魚蛋白肽對微管蛋白聚合-解聚反應的影響

根據其具體結合部位的不同，主要分為3類：紫杉醇位點抑制劑，長春堿位點抑制劑和秋水仙堿位點抑制劑。結合于紫杉醇位點的化合物是抑制微管蛋白解聚的微管蛋白聚合劑；而結合于后2個位點的抑制劑則正好相反，為微管蛋白解聚劑。無論是抑制聚合還是抑制解聚，均是通過干擾微管的動力學行為，而達到抑制微管正常功能的目的[17-19]。

從圖4可看出，甲魚蛋白肽對微管蛋白的聚合有明顯的抑制作用，且與濃度有關。甲魚蛋白肽的終濃度為0.5、0.75、1.5 mg·mL-1時，對微管蛋白聚合的抑制率分別為19.7%、25.6%、40.2%。甲魚蛋白肽對微管蛋白聚合的抑制作用與濃度呈正相關。

圖4 甲魚蛋白肽對微管蛋白聚合-解聚反應的影響

3 討論

國內外有關生物活性肽及其抗腫瘤的研究已顯示出強大的應用和開發前景[20-24]。1976年Pettit首次從海兔中發現環肽類抗腫瘤活性成分，其后從海兔中分離出一系列含量很低的小分子肽。易楊華等[23]從我國西沙群島永興島棕色海綿提取到一種新的類環肽化合物，具有較好的抗腫瘤活性。海鞘是抗腫瘤活性肽的重要資源之一[24]。研究人員從海洋藻類、魚類和貝類中發現了許多高活性的抗腫瘤肽[25-27]。本實驗以中性蛋白酶酶解制備的甲魚蛋白肽，在實驗濃度范圍內均有抑制肝癌HEPG2細胞增殖的作用。

微管是抗腫瘤藥物的重要作用靶點，微管蛋白在有絲分裂中的重要作用，使之成為抗腫瘤藥物的有力靶點。迄今為止，已發現了多種生物活性肽能夠影響微管蛋白的聚合-解聚。Pettit從海兔中分離出Dolastatin 10和Dolastatin 15能夠抑制微管聚合并促進其解聚，干擾腫瘤細胞的有絲分裂[22]。王翠翠等[28]研究表明，文蛤多肽能夠干擾微管蛋白的聚合。本實驗研究表明，甲魚蛋白肽對微管蛋白的聚合具有抑制作用，且與濃度呈正相關，提示甲魚蛋白肽具有潛在的抑制微管蛋白聚合的作用。

4 小結

本實驗評價了甲魚蛋白肽的抗腫瘤作用，在6.25～100 μg·mL-1，甲魚蛋白肽具有抑制腫瘤作用，并呈良好的量效關系，IC50為228.49 μg·mL-1。甲魚蛋白肽對微管蛋白的聚合具有抑制作用，且與濃度呈正相關，1.5 mg·mL-1的甲魚蛋白肽的抑制率達40.2%，提示甲魚蛋白肽對微管蛋白動態平衡體系的影響可能是抑制腫瘤細胞增殖的途徑之一。