我國東南沿海野生壇紫菜遺傳多樣性的AFLP分析

劉穎，張鵬，王鐵桿*，任鵬

(1.浙江省海洋水產養殖研究所，浙江 溫州 325005； 2.浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室，浙江 溫州 325005)

壇紫菜(Pyropiahaitanensis)屬于紅藻門(Rhodophyta)，紅藻綱(Rhodophyceae)，紅毛菜目(Bangiales)，紅毛菜科(Bangiaceae)，法紫菜屬(Pyropia)[1]。主要棲息在潮間帶，是我國特有暖溫帶性種類，分布于浙江、福建和廣東三省沿海[2]。壇紫菜是我國重要的經濟栽培海藻，其年產量約占全國紫菜年產量的75%[3]。壇紫菜養殖品種的最初來源是巖礁上的野生壇紫菜，盡管自20世紀60年代壇紫菜已實現了全人工栽培，但野生壇紫菜仍然是進行優質、高產、抗逆等特性選育和優化的重要種質來源[3-4]。豐富的遺傳多樣性是物種適應復雜自然環境的內在基礎，因此，研究野生壇紫菜的遺傳多樣性對壇紫菜的遺傳育種和種質資源保護具有重要意義[4]。近年來，隨著經濟的迅速發展，污染、養殖、堤壩建設等人類活動對潮間帶的生態和結構產生了重大影響[5]。壇紫菜作為生長于潮間帶的主要大型海藻之一，其自然資源已面臨嚴重衰退。而有關野生壇紫菜遺傳多樣性的報道卻很少[4,6-10]，尤其近4年已未見相關報道。因此，亟需對現存的壇紫菜野生群體進行資源調查和遺傳多樣性分析，旨在加強對自然資源的保護，以及為人工繁育選擇原始種質資源提供參考。

擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)具有靈敏度高、效率高、穩定性好、重復性好等特點[11]。作為最有效的分子標記之一，AFLP已被廣泛應用在藻類的種質鑒定[12-13]、遺傳多樣性分析[14-16]、連鎖圖譜構建等領域[17-18]。因此，本研究運用AFLP標記技術對采自浙江、福建和廣東三省沿海的6個壇紫菜野生群體進行遺傳多樣性及遺傳結構分析，實驗結果從分子水平揭示了我國東南沿海壇紫菜野生群體的遺傳多樣性現狀，對壇紫菜種質資源的評估和保護具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

壇紫菜分別隨機采集于浙江溫州竹嶼(ZY)、浙江臺州大陳島(DC)、福建平潭島(PT)、福建莆田南日島(NR)、福建寧德北礵島(BS)和廣東汕頭平嶼(PY)(表1)，共83株葉狀體樣品，陰干后帶回實驗室，存放于-20 ℃冰箱備用。

表1 野生壇紫菜樣品信息

1.2 基因組DNA的提取

用毛刷將保存的壇紫菜樣品在超純水中刷洗干凈，按照“DN14-植物基因組DNA快速提取試劑盒”(北京艾德萊生物科技有限公司，DN1401)的操作說明提取壇紫菜基因組DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，利用微量分光光度計(Nano-400)測定DNA的質量與濃度，將DNA濃度調至30 ng·μL-1，-20 ℃保存備用。

1.3 AFLP分析

AFLP分析流程參照Vos等[19]和王志勇等[20]的方法。實驗所用的內切酶(EcoRⅠ和MseⅠ)和T4 DNA連接酶為Fermentas公司生產；接頭和引物由英濰捷基(上海)公司合成，序列見表2。毛細管電泳檢測由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表2 AFLP引物與接頭序列

酶切體系：模板DNA(30 ng·μL-1)5 μL，EcoRⅠ(10 U·μL-1)0.1 μL，MseⅠ(10 U·μL-1)0.1 μL，10×Tango Buffer 4 μL，滅菌純凈水補齊至20 μL。反應條件：37 ℃酶切4 h，接著65 ℃酶切4 h，80 ℃滅活20 min。

連接體系：酶切產物5 μL，T4連接酶0.5 μL，10×T4 Buffer 1 μL，50% PEG4000 1 μL，EcoRⅠ接頭(5 μmol·L-1)0.5 μL，MseⅠ接頭(50 μmol·L-1)0.5 μL，滅菌純凈水補齊至10 μL，22 ℃連接1 h，70 ℃滅活5 min。

預擴增：連接產物1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2 μL，EcoRⅠ預擴增引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，MseⅠ預擴增引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.4 μL，滅菌雙蒸水補齊至20 μL。反應程序：94 ℃預變性2 min；進行20個循環(94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；72 ℃延伸10 min。

選擇擴增：預擴增產物稀釋10倍作為選擇性擴增模板。預擴增產物稀釋液2 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2 μL，EcoRⅠ引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，MseⅠ引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.4 μL，滅菌雙蒸水補齊至20 μL。反應程序：94 ℃預變性2 min；以每個循環降1 ℃的梯度從65 ℃退火到56 ℃退火(94 ℃變性30 s，65 ℃～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；然后進行27個循環(94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；72 ℃延伸10 min。從64對選擇性引物組合中篩選出樣品可以全部擴出、多態性高的8對引物組合進行群體選擇性擴增。

電泳檢測：選擇性擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行毛細管電泳。用ABI 3730XL自動測序儀(Applied Biosystems, USA)對PCR產物進行基因分型，用GeneMapper Software 5 進行等位基因大小分析。

1.4 數據分析

根據毛細管電泳結果選取片段大小在0～500 bp的片段進行統計，構建“0 1”矩陣，運用GenAIEx 6.51b2[21-22]計算種群內有效等位基因數(Ne)、Nei’s多樣性指數(H)、Shannon’s信息指數(I)、Nei’s遺傳距離和遺傳相似系數，以及進行ANOVA分析和二維主坐標分析(Principal coordinates analysis，PCoA)。根據Nei’s遺傳距離，使用軟件MEGA 7.0構建UPGMA聚類圖。觀測等位基因數(Na)、種群間遺傳分化系數(Gst)、種群間基因流動系數(Nm)由PopGen 3.2軟件計算完成。

2 結果與分析

2.1 AFLP擴增多態性

用篩選出的8對選擇性引物對6個壇紫菜群體的83個樣品進行AFLP分析，共得到1 261個有效位點，其中多態位點1 260個。不同引物擴增位點數為141～188個，平均每對引物擴增出157.63個AFLP位點。擴增位點最多的引物對是E-AGG/M-CAA。每對引物擴增的多態位點比例均大于99%(表3)。

表3 AFLP選擇性引物的擴增結果

2.2 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是生物對復雜環境適應能力的一種反應，是評價生物資源狀況的重要依據。由表4可知，6個壇紫菜群體的多態位點比例(PPL)為91.18%～98.89%，平均96.63%；Na為1.410 0～1.637 6，平均1.504 5；有效等位基因數(Ne)為1.189 0～1.243 0，平均1.225 4；I為0.186 3～0.244 4，平均0.222 8；H為0.118 9～0.152 9，平均0.141 7；無偏多樣性(uh)為0.129 7～0.166 8，平均0.153 4。其中DC群體的多樣性最豐富，NR群體的多樣性水平最低。

表4 6個壇紫菜群體的遺傳多樣性參數(平均值±標準誤)

2.3 遺傳結構分析

6個壇紫菜群體間Gst為0.248 0，表明遺傳變異主要來自群體內，Nm為1.519 6，表明不同地理群體的壇紫菜間存在一定的基因交流。ANOVA分析顯示(表5)，21.77%的變異來自群體間，78.23%的變異來自群體內，6個群體間的差異顯著。這與Gst=0.248 0的結果基本一致。

表5 基于壇紫菜AFLP數據的分子方差分析(ANOVA)

2.4 遺傳距離與聚類分析

6個壇紫菜群體間的遺傳相似性系數為0.898 8～0.970 6，遺傳距離為0.029 9～0.106 7，DC與ZY群體的遺傳相似系數最大(0.970 6)，遺傳距離最小(0.029 9)，說明這2個群體間的親緣關系最近，遺傳差異性最小。PY與NR群體的遺傳相似系數最小(0.898 8)，遺傳距離最大(0.106 7)，說明這2個群體的親緣關系最遠，差異性最大(表6)。

根據遺傳距離構建UPGMA聚類樹并進行個體主坐標分析(principal coordinates analysis，PCoA)。群體聚類顯示：6個群體聚為2大類，ZY和DC群體、PY和PT群體先分別聚為兩小支，再匯合為一大支，然后與BS群體聚在一起，而NR群體則單獨為一大支(圖1)。這一結果在PCoA數據中也得到了展示，從圖2中可以看出DC和ZY群體之間，PY、PT和BS群體之間存在一定程度的基因混雜，而NR群體與其他群體間則出現明顯分離。

表6 壇紫菜野生群體間Nei’s遺傳距離(左下角和遺傳相似性系數(右上角)

圖1 壇紫菜6個群體的UPGMA聚類分析

圖2 83個壇紫菜樣品的主坐標分析

3 討論

3.1 AFLP標記檢測效果評價

AFLP標記是多態條帶比例高、實驗結果穩定，不受基因組來源和復雜程度影響的標記，可以用于檢測親緣關系非常近的材料之間的差異[23-24]。Hu等[25]利用AFLP和SSR分析比較蓮(NelumbonuciferaGaertn)的遺傳多樣性時發現，AFLP標記在評估遺傳分化及親緣關系時比SSR更為準確，Liu等[11]利用AFLP技術揭示了中國沿海鼠尾藻的南北遺傳斷裂，表明AFLP技術用于群體遺傳多樣性和遺傳結構分析是可靠的。本研究利用AFLP技術對東南沿海壇紫菜野生群體進行分析，結果顯示，每對引物擴增的多態位點比例都大于99%，可見運用AFLP技術對壇紫菜進行遺傳多樣性研究十分有效。

3.2 野生壇紫菜的遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種或群體經過長期進化所積累的遺傳變異的總和[26]，能夠在一定程度上反映生物對復雜環境的適應能力[27]，對該生物的可持續發展、保護和利用有著重要意義[28]。近年來，受人類活動影響，富營養化、污染、水動力條件紊亂等對潮間帶的生態和結構產生了諸多影響[29]。壇紫菜是生長于潮間帶的主要大型海藻之一，生境的變化勢必會對其自然資源造成嚴重影響，近幾年我們在海區采樣時發現竹嶼(ZY)的野生壇紫菜已沒有每年都長出，所以亟需重新評估壇紫菜野生群體的遺傳多樣性現狀。由于野生壇紫菜主要附著于巖礁上采樣難度較高，有關野生壇紫菜種群遺傳多樣性的研究近幾年已未見報道，以往的研究采樣范圍較小，僅局限于某個省內[4,6-10]。本研究采用8對AFLP選擇性引物對采自浙江、福建和廣東三省沿海的6個壇紫菜野生群體共83個樣本進行了分析，結果顯示6個群體的多態位點百分率為91.18%～98.89%，平均96.63%，雖然6個群體的遺傳多樣性不同，但多態位點百分率都在90%以上，這一結果與楊銳等[6]、陳奕欣等[30]和王鑫等[31]用AFLP技術對紫菜進行遺傳多樣性分析得出的多態位點百分率相似。本研究得到的I為0.222 8，H為0.141 7，均低于陳昌生等[7]、紀德華[8]和Bi等[4]對福建野生壇紫菜和王金丹等[10]對浙南野生壇紫菜進行遺傳多樣性分析得到的結果，雖未達到顯著差異，但仍表明目前野生壇紫菜的遺傳多樣性已經有所下降。6個壇紫菜野生群體的uh為0.129 7～0.166 8，按無偏多樣性來排序，6個群體的遺傳多樣性順序為：DC群體>PT群體>BS群體>ZY群體>PY群體>NR群體，各個群體間的遺傳多樣性差異不顯著，并未表現出與地理位置的關聯。

3.3 壇紫菜野生群體間的基因交流

基因流動程度會對群體的遺傳結構產生重要影響，當種群基因流Nm大于1時，說明群體間有一定程度的基因流動，若Nm小于1，則說明群體間分化明顯[26]。本研究壇紫菜群體間的Nm為1.5196，說明這6個群體間存在一定的基因交流，由于大部分壇紫菜為雌雄同體，生殖方式主要是有性生殖，在其生活史中果孢子和殼孢子可以隨海流運動進行傳播，這給不同地理群體間的壇紫菜發生基因交流提供了條件[7]。另外，中國沿海同時存在南向和北向2種主要的洋流模式，使壇紫菜果孢子和殼孢子大范圍的漂移成為可能，而東南沿海江河眾多，大量淡水沖入大海勢必對鹽度、泥沙含量、渾濁度、營養鹽等與壇紫菜生長相關的因素造成影響，進而影響野生壇紫菜的自然分布。陳昌生等[7]利用ISSR對福建野生壇紫菜進行分析得出Nm為7.193 0，紀德華[8]利用SRAP對福建野生壇紫菜進行分析得出Nm為3.612 4，王金丹等[10]對浙南野生壇紫菜進行分析得到Nm為2.359 1，Bi等[4]利用SSR分析福建的野生壇紫菜得出Nm為2.542。與之前的數據相比目前壇紫菜野生群體間的基因交流減少，分化程度逐漸加大。推測這可能是造成野生壇紫菜遺傳多樣性降低的原因之一。ANOVA分析得出壇紫菜有21.77%的變異來自群體間，78.23%的變異來自群體內，來自群體間的變異大于陳昌生等[7]、紀德華[8]和Bi等[4]得到的結果，也表明野生群體間的分化正在加大。在UPGMA聚類圖中NR群體單獨聚為一類，而PCoA結果更清楚地顯示出NR群體已與其他地理群體明顯分開，分化明顯。目前，尚不清楚出現這一現象的原因，南日島周圍眾多的小島嶼可能成為了阻礙壇紫菜果孢子和殼孢子隨洋流運動的地理障礙，造成南日群體與其他群體的分化逐漸加大。

4 小結

綜上所述，我們利用AFLP分子標記技術檢測出我國東南沿海野生壇紫菜的遺傳多樣性呈下降趨勢，個別島嶼的種群已有衰退跡象，因此，需要加大對壇紫菜野生資源的保護，搶救式采集野生壇紫菜進行保種。另外，不同地理位置的壇紫菜野生群體間的基因交流減少，分化情況較之前更為明顯。本研究的數據有力補充了東南沿海地區野生壇紫菜的遺傳多樣性和遺傳結構信息，為及時了解野生壇紫菜資源現狀，制定資源保護及開發利用方案提供了理論支持。