浙江部分地區豬源鏈球菌的分離鑒定

曲業鵬，馮富，馬有智

(浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058)

豬鏈球菌病是由多種致病性鏈球菌引起的人畜共患病，具有較高的流行性[1]。豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)是該病最主要的病原菌，馬鏈球菌獸疫亞種、糞腸球菌、屎腸球菌、類豬鏈球菌等也易引發該病[2]。患豬鏈球菌病病豬臨床表現主要有腦膜炎、關節炎和敗血癥等[3]。在我國，隨著現代集約化豬場規模的不斷擴大，豬鏈球菌病發病率持續升高，嚴重影響養殖業的發展[4]。

近年來，隨著國內外學者對豬源鏈球菌生物學特性研究的不斷深入和分子生物學的不斷發展，PCR技術廣泛應用于細菌的鑒定。本研究對2016—2018年浙江部分地區部分規模化豬場采集到的病料樣品進行豬源鏈球菌的分離鑒定工作，旨在了解浙江地區鏈球菌的分布情況，從而為預防治療豬鏈球菌病提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

病料來源自2016—2018年浙江杭州、金華、舟山、義烏和紹興等地區規模化豬場的病死豬病料樣品；腦心浸出液肉湯(BHI)和胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購自北京陸橋公司；標準小牛血清購自上海聯碩公司；綿羊血購自浙江金華利民試劑經營部；DL2000 DNA Marker與2×TaqPCR Mastermix購自TaKaRa公司；引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1)。

1.2 細菌分離培養

綿羊血平板制備：稱取19 g TSA置于錐形瓶中，加入500 mL蒸餾水，水浴加熱使TSA完全溶解，高壓滅菌后將錐形瓶置于超凈工作臺冷卻至55 ℃左右，加入25 mL綿羊血，期間不斷振蕩錐形瓶使綿羊血與TSA充分混勻，然后將其倒入一次性培養皿中(每個20 mL)，待培養基冷卻凝固后放入4 ℃冰箱備用。

挑選病豬的肺臟、脾臟、肝臟、腎臟和淋巴結，用經酒精燈燒過的接種環蘸取臟器的病變部位，并畫線接種到血平板上，37 ℃培養18～24 h。無菌挑取單菌落劃線接種到血平板上純化，37 ℃培養18～24 h。

通過革蘭染色鏡檢與觸酶試驗，初步鑒定出疑似鏈球菌菌株。

1.3 DNA模板制備

分別挑取疑似鏈球菌菌株的單菌落接種到BHI液體培養基(含5%胎牛血清)中37 ℃過夜培養，取1 mL菌液于離心管中，12 000 r·min-1離心1 min，棄去上清液，加入100 μL雙蒸水，置于沸水中11 min，再將其置于冰水混合物中6 min，再次離心，取上清液。

1.4 豬源鏈球菌檢測

初步判定革蘭染色陽性、觸酶試驗陰性的鏈狀球菌為疑似鏈球菌，采用鏈球菌屬16SrRNA引物對疑似鏈球菌菌株進行PCR檢測。PCR反應體系(25 μL)包括：2×TaqPCR Mastermix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，用雙蒸水調整終體積至25 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min； 94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃延伸10 min，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 豬鏈球菌及其分型檢測

采用豬鏈球菌16SrRNA引物對鑒定為鏈球菌的菌株進行PCR檢測。PCR反應體系同1.4，退火溫度為60 ℃，其他反應條件參照1.4，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用豬鏈球菌CPS1、CPS2、CPS5、CPS7、CPS8、CPS9和CPS29引物分別對豬鏈球菌進行PCR分型檢測。PCR反應體系同1.4，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 非豬鏈球菌檢測

使用VITEK 2 Compact全自動細菌分析系統對非豬鏈球菌進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 豬源鏈球菌分離培養

從2016—2018年浙江地區規模化豬場送檢的病死豬病料中共分離到55株疑似豬源鏈球菌。通過染色鏡檢可發現疑似鏈球菌呈革蘭氏陽性，菌體為球形或橢圓形，單在、成對或鏈狀排列，在血平板上形成灰白色、光滑、圓形突起的小菌落，α溶血、β溶血和不溶血的現象均有出現。

2.2 豬源鏈球菌鑒定

55株疑似鏈球菌的PCR結果顯示，有51株為豬源鏈球菌，均有207 bp目的條帶。豬源鏈球菌中，有25株豬鏈球菌和26株非豬鏈球菌，檢出率分別為49.02%(25/51)和50.98%(26/51)。

2.3 豬鏈球菌及其分型鑒定

25株豬鏈球菌PCR分型檢測結果顯示：1、2、7、8、9和29型SS分別在637、498、379、268、388、263 bp處有目的條帶。結果見圖1。其中2型菌株分離率最高，為48%(12/25)；8型菌株分離率次之，為16%(4/25)；9型菌株分離率為12%(3/25)；7型菌株分離率為8%(2/25)；1型和29型菌株分離率最低，均為4%(1/25)；未定型菌株占8%(2/25)。詳見表2。

表2 豬鏈球菌分型鑒定

2.4 非豬鏈球菌鑒定

經VITEK微生物鑒定系統分析，26株非豬鏈球菌中，乳房鏈球菌、糞腸球菌、淺綠色氣球菌和屎腸球菌各分離到3株，分離率均為11.54%(3/26)；毗鄰鏈球菌分離率為7.69%(2/26)；停乳鏈球菌馬樣亞種、血鏈球菌、偽豕鏈球菌、豬腸鏈球菌、盲腸腸球菌、乳酸片球菌、耳炎差異球菌各分離到1株，分離率均為3.85%(1/26)；未確定到種的鏈球菌有5株，占19.23%(5/26)。詳見表3。

表3 非豬鏈球菌分離鑒定結果

3 討論

本研究對2016—2018年浙江地區規模化豬場病料樣品進行了分離鑒定，結果表明，51株豬源鏈球菌中SS分離率為49.02%，SS中1、2、7和9型分離率分別為4%、48%、8%和12%。趙戰勤等[4]對河南省及鄰近省份在2011—2015年分離到的310株豬源鏈球菌進行鑒定，結果顯示，SS有135株，分離率是43.55%，其中2型菌株的分離率達到53.3%，7型為10.4%，9型為10.4%，1型為1.5%，其他血清型占24.4%。Wei等[8]對中國16個省(市)患豬鏈球菌病的臨床樣本進行細菌分離鑒定，共得到719株鏈球菌，有407株SS，分離率是56.61%，其中2型分離率最高(43.2%)，7型和9型的分離率分別為3.7%和1.2%。本試驗中，豬源鏈球菌的檢出率與各型SS的檢出率與上述報道基本一致。

本試驗還分離到4株8型SS和1株29型SS，分離率分別為16%和4%，8型SS的分離率僅次于2型菌株，而陳雯雯等[7]對2017年廣西地區SS分離菌株進行分型鑒定發現，5、8、29型SS的檢出率分別為6.25%、31.25%和6.25%。盡管本試驗中8型SS的檢出率低于陳雯雯等報道的數據，但足以說明浙江地區存在8型SS，且有一定的流行趨勢。

本次試驗中，51株豬源鏈球菌中有26株非豬鏈球菌，分離率為50.98%，其中乳房鏈球菌、糞腸球菌、淺綠色氣球菌和屎腸球菌均占11.54%，毗鄰鏈球菌分離率為7.69%，停乳鏈球菌馬樣亞種、血鏈球菌、偽豕鏈球菌、豬腸鏈球菌和盲腸腸球菌等各占3.85%。賀名葉等[9]對湖南地區一些病死豬樣本病原菌的鑒定結果顯示：36株豬源鏈球菌中，除SS外另有12株種類不同的鏈球菌，分離率達到33.33%，其中淺綠氣球菌占25.0%，馬鏈球菌獸疫亞種、糞腸球菌、屎腸球菌、肺炎鏈球菌和停乳鏈球菌等各占8.33%。雖然本次試驗中各鏈球菌屬菌株的分離率與上述報道有差異，但也說明多種鏈球菌可引發豬鏈球菌病。腸球菌屬原屬于D群鏈球菌屬成員，與鏈球菌屬非常相似，分離鑒定時容易被誤判為鏈球菌。