液相色譜串聯質譜快速檢測水中喹諾酮類藥物及其應用

何欣，柳愛春，劉超，白俊慧，虞軼俊，趙蕓*，丁明

(1.杭州市農業科學研究院 實驗中心，浙江 杭州 310024； 2.浙江省耕地質量與肥料管理總站，浙江 杭州 310020;3.中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，浙江 杭州 311400)

喹諾酮類藥物是一類比較新的合成抗菌藥，抗菌譜廣，抗菌力強，口服吸收好，組織濃度高，與其他抗菌藥物無交叉耐藥性，不良反應相對較少，現已經成為治療細菌感染性疾病的主要藥物，在臨床治療和農業生產中廣泛應用。然而，近些年的研究表明，喹諾酮類藥物除了會引起胃腸道反應、中樞神經系統異常、軟骨毒性、心臟毒性等方面的不良反應外[1-4]，還有生態毒性。我國有超過半數的喹諾酮類抗生素被用在畜禽與水產養殖中，動物與水生生物體內抗生素的蓄積易導致細菌耐藥性的產生，進而可能影響到人類健康[5]。同時，抗生素在生物體內的利用度較低，絕大多數抗生素藥物最終會進入到環境中，殘留在環境中的喹諾酮類抗生素一旦進入水體，就有可能對水環境中的非靶生物及生態系統產生不良影響[6-8]。

關于抗生素在水體中的含量檢測方法已有一些報道，包括快速檢測試劑盒、酶聯免疫檢測、毛細管電泳分析和液相分析等。其中，液相色譜串聯質譜技術因具有高準確度和高靈敏度而成為目前主要應用的化學分析技術[9-12]。本研究建立了一種可對水中15種喹諾酮類藥物進行快速檢測的方法。該方法有助于加深對水體本底中抗生素含量和種類變化的了解，明確抗生素在環境中的遷移信息和防范風險，同時，相關研究的結果還可為相關部門制定規范、標準提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯質譜儀(UPLC-MS/MS)：Waters Xevo TQ-S，配電噴霧離子源(ESI)，Waters公司；高速離心機，Bioridge公司。氮吹儀，Organomation公司。

甲醇，色譜純，Fisher Chemical公司。甲酸，色譜純，ROE Scientific公司。乙腈，色譜純，Fisher Chemical公司。15種喹諾酮類藥物(氟甲喹、諾氟沙星、依諾沙星、環丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、麻保沙星、氟羅沙星、加替沙星、沙拉沙星、司帕沙星、雙氟沙星)標準品，純度≥95%，DR公司。

固相萃取小柱：60 mg/3 mL，Waters公司；微孔有機濾膜，0.22 μm。

另配制NaH2PO4、Na2HPO4物質的量之比為9∶1的0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液。

1.2 樣品制備與前處理

將1 L混勻的水樣，經布氏漏斗過濾后，收集濾出液，重復收集一次，合并濾液，過0.22 μm水相濾膜，準確量取500 mL備用。

準確量取500 mL水樣于1 000 mL引流設備中，加入50 mL 0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液，用玻棒混勻2 min，室溫下避光引入3 mL的固相萃取柱上，固相萃取柱先以5 mL甲醇活化，用5 mL超純水洗滌。水樣以1 mL·min-1左右的流速經過固相萃取柱后，加入3 mL 5%(體積分數)的甲醇洗滌，用6 mL甲醇洗脫。洗脫液在40 ℃下氮氣吹干后，用流動相定容至0.5 mL，渦旋30 s后轉移至2 mL高速離心管，15 000 r·min-1離心10 min，過0.22 μm濾膜，濾液上機待用。

1.3 色/質譜條件優化

1.3.1 質譜條件

采用直接注射方式進樣，對15種喹諾酮類藥物標準溶液(1.0 μg·mL-1)分別在正離子模式下進行質譜采集，獲得15種喹諾酮類藥物的母離子信息。通過改變碰撞能量，確定1～2個特征碎片，作為藥物對應的子離子。同時，優化錐孔電壓等參數，使得目標物的信號最強，確定檢測目標物的定量離子對、定性離子對、錐孔電壓、碰撞能量等參數。

1.3.2 色譜條件

比較 ACQUITY BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)、ACQUITY BEH Hilic(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)、ACQUITY BEH amide(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)和ACQUITY HSS T3(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)色譜柱作為分離材料的效果。在以下條件先進行藥物的分離。流動相A，水；流動相B，100%乙腈。程序：0～1 min，流動相A體積分數95%～90%，流動相B體積分數5%～10%；1～5.5 min，流動相A體積分數90%～10%，流動相B體積分數10%～90%；5.5～6 min，流動相A體積分數10%～90%，流動相B體積分數90%～10%；6～7 min，流動相A體積分數90%～95%，流動相B體積分數10%～5%。選取峰形和響應值均較好的色譜柱，優化流動相條件，優化時間梯度。

1.4 前處理方法優化

比較極性HLB固相萃取柱、混合型陰離子交換柱(MAX)和混合型陽離子交換柱(MCX)凈化材料的吸附能力，比較甲醇和乙腈的洗脫效果，并對比pH分別為5.8、6.4和7.8時對提取樣品中15種目標物進行分析的效果。

1.5 方法學驗證和應用

方法準確度采用空白樣品加標試驗確定。對水樣進行3個水平的加標回收試驗(n=6)?？瞻讟悠分校謩e以不同藥物響應信號與噪音比為3倍和10倍定為檢出限(LOD)與定量限(LOQ)，各藥物的加標水平分別為LOQ、10×LOQ和100×LOQ，各藥物加標水平設置為1.0～100 ng·L-1。對水樣進行重復測定(n=6)，計算各藥物平行測定的相對標準偏差(RSD)，并將建立的方法應用于杭州市水體9個斷面中采樣所得的樣品。

2 結果與分析

2.1 質譜檢測參數

采用直接注射方式進樣，對15種喹諾酮類藥物標準溶液(1 μg·mL-1)分別在正離子模式下進行質譜采集。結果顯示，15種喹諾酮類藥物具有較高的靈敏度，且主要以[M+H]+分子離子形式存在。每個分析物母離子選擇2～4個信噪比(S/N)較高的子離子，優化錐孔電壓，碰撞能量等質譜參數(表1)。

2.2 色譜條件優化

2.2.1 色譜柱選擇

比較了4種色譜柱的分離效果，結果發現，在相同的洗脫條件下，各目標物在T3和Hilic色譜柱上分離度較差，在C18和amide上各藥物均有不錯的分離效果，但amide柱上信號較差，靈敏度比C18柱低。原因可能是：C18和Amide柱配基密度低，使得分析物能更容易地進入填料的微孔結構中，為極性和疏水性分子提供均衡的保留性能。綜合來看，選擇C18作為色譜柱。

2.2.2 流動相優化

改變流動相，在水相中加入0.1%(體積分數)甲酸后峰形和響應度大大提高。這是因為，加入甲酸后改變了流動相的pH值，使得目標物更容易吸附在色譜柱上，同時可使樣品在質譜中的離子化程度大大提高，從而提升檢測的靈敏度。

表1 UPLC-MS/MS法測定喹諾酮類藥物的質譜參數

注：加粗為定量離子對。

對洗脫程序進行優化，結果發現，樣品在水相為50%時已經完全洗脫，故可將洗脫梯度修改為流動相A，0.1%(體積分數)甲酸水溶液；流動相B，100%乙腈。程序修改為：0～1 min，流動相A體積分數95%～90%，流動相B體積分數5%～10%；1～5.5 min，流動相A體積分數90%～50%，流動相B體積分數10%～50%；5.5～6 min，流動相A體積分數50%～90%，流動相B體積分數50%～10%；6～7 min，流動相A體積分數90%～95%，流動相B體積分數10%～5%。流速0.4 μL·min-1。15種分析物的UPLC-MS/MS色譜圖如圖1所示，各目標物均得到較好的保留和分離。

2.3 凈化效果評價

試驗發現，HLB固相萃取小柱對所有喹諾酮類藥物均有一定的吸附作用，而MAX和MCX小柱吸附能力較差。為此，本方法選用HLB柱作為凈化材料。

以混合標準溶液(含各分析物100 ng·mL-1)作為監測和評價對象，比較分析了純水和5%(體積分數)甲醇水溶液的淋洗效果，以及甲醇和乙腈的洗脫效果。選擇5%的甲醇溶液可避免喹諾酮類藥物在淋洗環節被洗脫，但如采用純水進行淋洗，則無法達到對雜質的清除效果。經比較，采用5%甲醇水溶液作為淋洗液，更有助于降低基質效應。

考查甲醇和乙腈溶液對目標物的洗脫效果，結果表明：2種有機溶劑對各分析物均有良好的洗脫效果?？紤]到乙腈過強的洗脫能力可能會引入較多的雜質并具有較大的毒性，因此,選擇甲醇作為洗脫劑。

圖1 優化后的各組分液相色譜

比較體積分別為3、6、10 mL的甲醇溶液的洗脫效果，結果表明，當采用6 mL的甲醇作為洗脫溶液時，回收率與10 mL甲醇的洗脫回收率基本一致，可滿足定量分析要求。最終選擇的洗脫液為6 mL的甲醇溶液。

2.4 提取效果

喹諾酮類藥物分子極性較強，在不同的pH環境下，固相萃取柱對喹諾酮類藥物的吸附、洗脫效果差異較大。設置不同的pH條件，對提取樣品中15種目標分析物的效果進行比較。采用0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液調節pH，當NaH2PO4和Na2HPO4的物質的量之比分別為9∶1、1∶1和1∶9時，溶液pH值分別為5.8、6.4和7.8。向500 mL的過濾液中加入50 mL的磷酸鹽緩沖液進行提取和富集。結果表明：在酸性環境下，即NaH2PO4和Na2HPO4的物質的量之比為9∶1時，喹諾酮類藥物的提取富集效果較好，此時的溶液pH值約為5.8，會給萃取過程提供酸性環境，使得喹諾酮類藥物更易富集在固相萃取柱上。

2.5 方法學驗證及應用

試驗結果表明，在100 ng·L-1的加標質量濃度下，上述方法的總體加標回收率為50.41%～111.64%，RSD為1.12%～14.26%，可滿足方法的準確度要求。

試驗對水樣進行了3個水平的加標回收試驗(n=6)。對于水樣空白基質，各抗生素的加標水平分別為各自定量限LOQ、10×LOQ和100×LOQ，各藥物加標水平分別設置為1.0、10.0、100 ng·L-1。水樣樣品的加標回收率為50.41%～111.64%，RSD為1.12%～14.26%，方法精密度可滿足相關技術要求。

本方法為外標法定量。在確定的最佳條件下，按各分析物的響應值，將15種喹諾酮類藥物配制成含1.0～100 ng·mL-1的混合標準工作溶液，做工作曲線。結果表明，本方法下各分析物濃度與質譜響應值的線性關系良好，其決定系數(R2)均大于0.990；各藥物的最低LOD為1.0 ng·L-1，LOQ為1.0 ng·L-1(表3)。

將建立的方法應用于27個水樣中，其中陽性樣品4個，陽性率為14.81%。其中，檢測出的喹諾酮類藥物種類有麻保沙星、恩諾沙星和氧氟沙星。

表2 喹諾酮類藥物加標回收試驗結果(n=6)

表3 喹諾酮類藥物的線性關系、方法檢出限和定量限

3 小結

本研究建立了一種可對水中15種喹諾酮類藥物進行快速檢測的方法。水樣經過濾、提取，在HLB固相萃取柱上濃縮1 000倍，凈化，UPLC-MS/MS檢測，樣品的回收率為50.41%～111.64%，RSD為1.12%～14.26%，檢出限和定量限為1.0 ng·L-1。將建立的方法應用于水樣中，檢測出陽性樣品4個，陽性率為14.81%，其中，檢測出的喹諾酮類藥物種類有麻保沙星、恩諾沙星和氧氟沙星。