EDDS對鉛鎘復(fù)合脅迫下黑麥草幼苗生理生化的影響

溫昱晨，郝宇，解琳，張東向，莫繼先，劉本松，金忠民

（1. 齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 海南地質(zhì)綜合勘察設(shè)計院，海南 海口 570100）

近年來我國工業(yè)發(fā)展迅速，由于“三廢”治理不徹底和過量使用化肥農(nóng)藥等原因，導(dǎo)致我國土壤重金屬污染日趨嚴(yán)重，影響植物的正常生長發(fā)育[1]．鉛鎘是植物生長發(fā)育過程中的非必需元素，對自然界有較大危害，可通過食物鏈進(jìn)入人體，土壤中鉛、鎘、汞、砷、鉻合稱為“五毒元素”[2]．在鉛鎘脅迫下，植物代謝會產(chǎn)生活性氧（ROS），過多積累會對植物造成傷害[3]，而植物體內(nèi)的抗氧化酶主要包含超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等，并且能夠清除體內(nèi)的活性氧（ROS）[4]．鎘與葉綠體中蛋白質(zhì)的巰基相結(jié)合，可以破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)一步使葉綠素（CHL）降解，對植物光合作用產(chǎn)生巨大影響[5]．

黑麥草（Lolium perenneL）是多年生優(yōu)良牧草，細(xì)弱根狀莖，適宜生長在溫和濕潤環(huán)境，在10～27 ℃之間都能較好生長，其生長周期短，生物量大，適應(yīng)性強[6]，具有富集重金屬能力，單獨種植時具有較大的富集系數(shù)（0.75）[7]．

乙二胺二琥珀酸（EDDS）是一種可降解、配合能力強且容易與重金屬相結(jié)合的螯合劑[8]．EDDS可以與土壤中的鎘結(jié)合，酸可提取態(tài)鎘含量隨EDDS濃度的增加而增加，能有效活化鎘[9]．合適的螯合劑經(jīng)螯合作用可以改變土壤重金屬活度，從而達(dá)到重金屬吸收積累到植物地上部分的目的[10]．研究表明，螯合劑具有誘導(dǎo)植物提取土壤中重金屬的能力，其能力與植物品種、土壤性質(zhì)、重金屬本身屬性及螯合劑施加方式有關(guān)[11]，選擇適宜的EDDS濃度對修復(fù)鉛鎘污染的農(nóng)用地具有重要意義．

研究EDDS對鉛鎘復(fù)合脅迫下黑麥草SOD，POD，CAT，CHL的影響，為針對不同程度鉛鎘污染的土壤選用相適應(yīng)濃度的EDDS提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黑麥草種子（北京金農(nóng)豐源種子公司）；實驗用土壤（齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院植物園）．

1.2 實驗方法

使用硫酸鎘和硝酸鉛配制不同質(zhì)量濃度得鉛鎘混合溶液處理土壤，設(shè)置鉛鎘質(zhì)量濃度梯度為0，0；150，15；300，30；600，60；1200，120 mg/kg，分別記為T0，T1，T2，T3，T4．將土壤放置6 個月，待用，通過盆栽實驗種植，精選飽滿的黑麥草種子，先用水浸泡12 h后再用70%乙醇消毒，晾干后播種，室溫培養(yǎng)．待生長30 d后，分別向各處理組的根部注射不同濃度的EDDS，設(shè)置EDDS濃度梯度為0，0.3，0.6，1.2，2.4 mmol/kg，EDDS注射量為每盆20 mL，每組處理3個平行，培養(yǎng)7 d后，選取長勢一致的黑麥草幼苗進(jìn)行各項生理指標(biāo)的測定．

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 氮藍(lán)四唑法測定SOD活性[12]SOD活性其中：ACK為對照管OD值；AE為測定管OD值；VT為酶提取液總體積（mL）；Vt為測定時樣品用量體積（mL）；m為樣品鮮質(zhì)量（g）．

1.3.2 愈創(chuàng)木酚法測定POD活性[13]POD活性其中：ΔA470為反應(yīng)時間內(nèi)吸光值的改變值；VT為提取酶液總體積（mL）；VS為測定時吸取酶液用的體積（mL）；m為樣品鮮質(zhì)量（g）；t為反應(yīng)時間（min）；0.01為ΔA470為每下降0.01為一個酶活單位．

1.3.3 紫外分光光度法測定CAT活性[14]CAT活性其中：ΔA為反應(yīng)時間內(nèi)吸光值的改變；V為提取酶液總體積（mL）；V為測定時240TS吸取酶液的體積（mL）；m為樣品鮮質(zhì)量（g）；t為反應(yīng)時間（min）；0.1為ΔA240每下降0.1為一個酶活單位；A0為對照管為加入煮沸酶液的吸光值；A1，A2為測定吸光值．

1.3.4 分光光度計法測定 CHL含量[15]CHL質(zhì)量分?jǐn)?shù)其中：c=ca+cb，ca=13.95A665-6.88A649，cb=24.96A649-7.32A665，c為色素的質(zhì)量濃度（mg/L），ca和cb分別為葉綠素 a和葉綠素b的質(zhì)量濃度（mg/L）；V為提取液總體積（mL）；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品鮮質(zhì)量（g）．

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性分析，采用Prism軟件進(jìn)行制圖．

2 結(jié)果與分析

2.1 EDDS對鉛鎘復(fù)合脅迫下黑麥草幼苗SOD活性的影響

SOD具有清除植物體內(nèi)ROS的功能，主要機制是清除超氧陰離子自由基（O2-）[16]．不同濃度的EDDS對不同鉛鎘質(zhì)量濃度處理下黑麥草幼苗SOD活性的影響見圖1．由圖1可見，T0組中不同EDDS濃度下黑麥草幼苗SOD活性差異不顯著，說明在無鉛鎘脅迫下EDDS對黑麥草幼苗SOD活性的影響較小．T1組中，隨著EDDS濃度的增加，葉片SOD的活性增加，分別比T0組低59.19%，56.99%，52.49%，46.14%，33.73%，說明土壤中的鉛鎘影響黑麥草幼苗SOD活性．T2，T3，T4組內(nèi)的SOD活性也逐漸增加，說明EDDS可以增加黑麥草幼苗SOD活性，對鉛鎘復(fù)合脅迫下的黑麥草起到緩解作用．在未加EDDS的條件下，隨著鉛鎘復(fù)合質(zhì)量濃度的增加，黑麥草SOD活性呈先增加后減少的趨勢，說明黑麥草自身具有一定抵抗鉛鎘脅迫的能力．在EDDS濃度為2.4 mmol/kg時，隨鉛鎘復(fù)合質(zhì)量濃度的增加，黑麥草幼苗SOD活性呈先增加后減少的趨勢，說明并不是EDDS濃度越高對鉛鎘脅迫下黑麥草幼苗的緩解效果越好，應(yīng)根據(jù)不同的鉛鎘污染程度選擇不同的EDDS濃度．在土壤鉛鎘質(zhì)量濃度為600，60 mg/kg時，施加濃度為2.4 mmol/kg的EDDS使黑麥草SOD活性達(dá)到最大，說明在此土壤污染程度下施加EDDS濃度為2.4 mmol/kg時對黑麥草的緩解效果最好．在T3組中，施加EDDS濃度為0.3，0.6，1.2 mmol/kg時，SOD含量差異不顯著（p＞0.05），EDDS濃度為2.4 mmol/kg時SOD含量最高，與不同EDDS濃度下SOD含量差異顯著（p＜0.05）．當(dāng)施加濃度為2.4 mmol/kg的EDDS時，鉛鎘質(zhì)量濃度為1200，120 mg/kg下的SOD活性比鉛鎘質(zhì)量濃度為600，60 mg/kg下的SOD活性減少了27.92%，說明土壤中鉛鎘含量過高時，EDDS對黑麥草幼苗的緩解能力減弱．對照與T0組中EDDS濃度為0.3，0.6，1.2 mmol/kg的SOD含量相比，差異不顯著（p＞0.05），對照與在其它鉛鎘復(fù)合質(zhì)量濃度和EDDS濃度下的SOD含量相比，差異顯著（p＜0.05）．

圖1 不同濃度EDDS對不同鉛鎘質(zhì)量濃度處理下黑麥草幼苗SOD活性的影響

2.2 EDDS對鉛鎘復(fù)合脅迫下黑麥草幼苗POD活性的影響

POD在植物組織中大量存在，活性較高，與植物的光合作用、呼吸作用以及生長素的氧化密切相關(guān)[17]．不同濃度EDDS對不同鉛鎘質(zhì)量濃度處理下黑麥草幼苗POD活性的影響見圖2．由圖2可見，T1組隨著EDDS濃度的增加，黑麥草幼苗POD的活性增加，分別比T0組低73.98%，67.09%，58.01%，44.88%，35.94%，說明鉛鎘對黑麥草幼苗POD活性有影響，EDDS能緩解鉛鎘對黑麥草幼苗的傷害．在T2組中，EDDS濃度為0，0.3，0.6 mmol/kg時，植物地上部分POD含量差異不顯著（p＞0.05），EDDS濃度為1.2，2.4 mmol/kg時，葉片POD含量差異不顯著（p＞0.05）．在T3組中EDDS濃度為2.4 mmol/kg時，黑麥草幼苗POD活性達(dá)到最大，與組內(nèi)相比差異顯著（p＜0.05），說明在土壤鉛鎘質(zhì)量濃度為 600，60 mg/kg下，施加濃度為2.4 mmol/kg的EDDS對黑麥草幼苗的緩解效果最好．在不加EDDS下的黑麥草幼苗，隨復(fù)合鉛鎘質(zhì)量濃度的增加，黑麥草幼苗POD活性呈先增加后減少的趨勢，說明黑麥草幼苗能適應(yīng)低質(zhì)量濃度的鉛鎘含量，可自身調(diào)節(jié)鉛鎘脅迫帶來的危害．對照與T0組中EDDS濃度為0.3，0.6，1.2，2.4 mmol/kg的POD含量相比，差異不顯著（p＞0.05），對照與其它鉛鎘復(fù)合質(zhì)量濃度和EDDS濃度下的POD含量相比，差異顯著（p＜0.05）．

圖2 不同濃度EDDS對不同鉛鎘質(zhì)量濃度處理下黑麥草幼苗POD活性的影響

2.3 EDDS對鉛鎘復(fù)合脅迫下黑麥草幼苗CAT活性的影響

CAT與SOD，POD相類似，在植物組織中的含量也很高，主要機制是將過氧化氫分解為氧氣和水，使植物機體免受毒害[18]．不同濃度EDDS對不同鉛鎘質(zhì)量濃度處理下黑麥草幼苗CAT活性的影響見圖3．由圖3可見，T0組中不同濃度EDDS下黑麥草幼苗CAT的活性差異不顯著（p＞0.05），說明在無鉛鎘脅迫下EDDS對黑麥草幼苗CAT的活性影響較小．在T1組內(nèi)，隨著EDDS濃度的增加，黑麥草CAT活性呈先增加后減少的趨勢，處理組（T1）比T0分別低61.5%，54.83%，49.3%，35.64%，47.57%，在T1組內(nèi)，雖然EDDS濃度為0.6，1.2，2.4 mmol/kg時植物葉片CAT含量差異不顯著（p＞0.05），但EDDS為1.2 mmol/kg時植物葉片CAT含量稍高，說明鉛鎘脅迫明顯改變黑麥草幼苗CAT活性，EDDS濃度為1.2 mmol/kg時能較好地緩解鉛鎘脅迫下黑麥草幼苗的傷害．在不同鉛鎘復(fù)合質(zhì)量濃度下，隨EDDS濃度的增加，黑麥草幼苗CAT的活性均呈先增加后減少的趨勢，說明適當(dāng)?shù)腅DDS濃度能減緩鉛鎘給黑麥草幼苗帶來的傷害，而過高濃度的EDDS會加重傷害．在鉛鎘質(zhì)量濃度為600，60 mg/kg，施加1.2，2.4 mmol/kg的EDDS時，黑麥草葉片CAT含量差異不顯著（p＞0.05），但EDDS為1.2 mmol/kg時CAT含量較高，說明1.2 mmol/kg的EDDS對600，60 mg/kg鉛鎘下的黑麥草幼苗緩解效果較好．對照與T0組中EDDS濃度為0.3，0.6，1.2，2.4 mmol/kg的CAT含量相比，差異不顯著（p＞0.05），對照與其它鉛鎘復(fù)合質(zhì)量濃度和EDDS濃度下的CAT含量相比，差異顯著（p＜0.05）．

圖3 不同濃度EDDS對不同鉛鎘質(zhì)量濃度處理下黑麥草幼苗CAT活性的影響

2.4 EDDS對鉛鎘復(fù)合脅迫下黑麥草幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素直接參與光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化等過程，在光合過程中起著至關(guān)重要的作用[19]．不同濃度EDDS對不同鉛鎘質(zhì)量濃度處理下黑麥草幼苗葉綠素的影響見圖4．由圖4可見，T0組中不同濃度EDDS對黑麥草葉片葉綠素含量影響差異不顯著（p＞0.05）．T1組比T0組分別低31.07%，38.09%，43.82%，47.81%，50.00%，說明鉛鎘影響黑麥草幼苗葉綠素的含量．從T1，T2，T3組可以看出，隨著EDDS濃度的增加，黑麥草幼苗葉綠素的含量均呈逐漸減少的趨勢，說明EDDS能使鉛鎘脅迫下黑麥草幼苗失綠，影響光合作用，進(jìn)而影響植物生長發(fā)育．在T1組中，黑麥草葉片葉綠素含量在EDDS濃度為0，2.4 mmol/kg兩者比較下差異顯著（p＜0.05），而EDDS濃度在相鄰梯度之間時，葉綠素含量差異不顯著（p＞0.05）．在T2，T3組內(nèi)也存在與T1組相同的情況．在未加EDDS的條件下，隨鉛鎘復(fù)合質(zhì)量濃度的增加黑麥草幼苗葉綠素的含量減少，說明越高質(zhì)量濃度的鉛鎘對黑麥草幼苗葉綠素含量的影響越大．在T4組內(nèi)，葉綠素含量呈先減少后增加的趨勢，在EDDS濃度為2.4 mmol/kg時葉綠素含量最高，說明此時的EDDS濃度對鉛鎘質(zhì)量濃度為1200，120 mg/kg下的黑麥草幼苗緩解效果最好．對照與T0組中EDDS濃度為0.3，0.6，1.2，2.4 mmol/kg的葉綠素含量相比，差異不顯著（p＞0.05），對照與其它鉛鎘復(fù)合質(zhì)量濃度和 EDDS濃度下的葉綠素含量相比，差異顯著（p＜0.05）．

圖4 不同濃度EDDS對不同鉛鎘質(zhì)量濃度處理下黑麥草幼苗葉綠素的影響

3 討論

在農(nóng)業(yè)種植方面，農(nóng)藥、化肥及塑料薄膜的大量使用會造成農(nóng)用地鉛鎘污染．鉛鎘在土壤中具有極強的積累性、不可降解性，因此農(nóng)業(yè)土壤中鉛鎘的過量積累對糧食安全和人類健康存在巨大風(fēng)險[20]．有研究表明，在鎘脅迫下的黑麥草，通過添加外源EDDS可使其體內(nèi)SOD，POD，CAT活性顯著增加[21]，這與本實驗結(jié)果相似．分別從不同復(fù)合鉛鎘質(zhì)量濃度處理來看，隨EDDS濃度的增加，SOD，POD的活性均呈逐漸增加的趨勢，在EDDS濃度為2.4 mmol/kg時，SOD和POD活性達(dá)到了最大，故在EDDS濃度為2.4 mmol/kg時，能較好地緩解鉛鎘對植物的危害．有研究發(fā)現(xiàn)在鎘質(zhì)量濃度為40 mg/kg的脅迫下，隨EDDS濃度的增加，葉片中CAT活性呈先升后降的趨勢，其活性均顯著高于對照[22]．本實驗證實了這一點，在不同復(fù)合鉛鎘質(zhì)量濃度下，隨 EDDS濃度的增加，黑麥草 CAT的活性均呈先增加后減少的趨勢．在鉛鎘質(zhì)量濃度為600，60 mg/kg和EDDS濃度為1.2 mmol/kg時，黑麥草幼苗CAT活性達(dá)到了最高，此時EDDS是緩解鉛鎘質(zhì)量濃度為600，60 mg/kg下黑麥草幼苗傷害的最適濃度．葉綠素是植物細(xì)胞的重要色素，其含量減少，光合作用強度下降，植物體內(nèi)有機物合成減少，導(dǎo)致植物死亡[23]．實驗結(jié)果表明，在T1，T2，T3組中，隨EDDS濃度的增加，葉綠素含量呈逐漸減少的趨勢，EDDS濃度均在2.4 mmol/kg時葉綠素含量最少．這與前人研究結(jié)果相似，EDDS能促進(jìn)鉛鎘由植物根部向地上的轉(zhuǎn)運，使高羊茅和紅三葉2種植物葉片的葉綠素含量下降[24]．在T4組中，施加0.6 mmol/kg的EDDS使葉綠素含量最少，可能與螯合程度有關(guān)，可進(jìn)一步探究植物地上部分鉛鎘含量加以分析．綜上所述，當(dāng)土壤鉛質(zhì)量濃度在150～600 mg/kg，鎘質(zhì)量濃度在15～60 mg/kg之間時施加1.2～2.4 mmol/kg的EDDS能較好地緩解鉛鎘帶來的危害．

劉金[25]等研究發(fā)現(xiàn)，EDDS在濃度為1.5～3 mmol/kg時，促進(jìn)苧麻對鎘的富集．本實驗只做到在不同復(fù)合鉛鎘質(zhì)量濃度脅迫下，通過施加不同濃度的EDDS選出對黑麥草幼苗緩解傷害效果最好的濃度，為不同鉛鎘污染程度的土壤選用相適應(yīng)的EDDS濃度提供理論依據(jù)，后續(xù)可以研究EDDS對鉛鎘脅迫下黑麥草幼苗的富集，為植物修復(fù)奠定基礎(chǔ)．如果通過EDDS進(jìn)行植物修復(fù)，富集鉛鎘后的植物要處理得當(dāng)，進(jìn)行定期回收，否則容易造成二次污染，后面的研究應(yīng)尋找處理植物的最佳辦法．在治理農(nóng)業(yè)土壤時，針對不同程度的污染區(qū)，選用適當(dāng)濃度EDDS，才能有效治理受污染的土壤，避免對土壤的二次污染和肥力降低．

4 結(jié)論

（1）黑麥草對鉛鎘有一定的抗性，能通過自身調(diào)節(jié)過氧化酶的活性．

（2）在鉛鎘脅迫下，添加適當(dāng)濃度的 EDDS有利于緩解黑麥草幼苗的傷害，過高容易損害植物，過低則緩解傷害的效果不佳．

（3）根據(jù)不同程度鉛鎘污染的土壤應(yīng)選擇相適應(yīng)的EDDS濃度，才能有效地緩解鉛鎘帶來的危害．