益生菌檢測在食品微生物實驗教學中的應用

劉麗艷，王 文，蘇健裕

(華南理工大學輕工與食品實驗教學中心，食品科學與工程學院，廣東 廣州510640)

0 引言

食品微生物學是一門具有較強實驗性的專業基礎課，對于培養食品領域人員的食品微生物檢驗技術、食品質量控制能力及衛生安全意識具有重要意義。“微生物學實驗”是微生物學教學不可分割的一部分，同時也是所有食品和生命科學研究的實驗基礎。現有的實驗教學，重點培養學生掌握單項實驗技能和熟練實驗操作，如細菌染色及顯微觀察、霉菌菌種培養及觀察、酵母計數和大小測定等，較好地完成了理論課知識的驗證。但由于實驗課學時、實驗內容安排順序和關聯性等因素限制，課程結束后學生對科學研究的認知度仍然欠缺，理論聯系實際的能力不足，所以需要開展結論未知的綜合型探索性實驗，把食品微生物實驗課程各單項整體應用起來，增強各單項之間的關聯性，設計貼近日常生活的實驗題目[1]。在保障本科生掌握微生物基本實驗技能的基礎上，幫助學生從學習單項實驗操作，發展為從文獻檢索和實驗設計到團結協作完成實驗。從而不斷提高本科生的實驗技能和提升對實驗整體性和系統性的宏觀認知，激發本科生實驗興趣，以培養出既具有扎實理論基礎，又有較高實驗技能和實驗創新能力的食品領域工作者[2-3]。

目前，益生菌已廣泛用于乳制品行業[4-5]。該文從實驗教學內容選擇、教學過程管理和完善考核制度等方面探討和總結探索性實驗項目在食品微生物學本科實驗課上的應用，為食品微生物學實驗教學體系更新提供一些思路，供同類課程交流和探討。

1 發酵奶制品中益生菌檢測實驗

1.1實驗目的

掌握滅菌、梯度稀釋和不同食品中微生物的測定、分離、接種、培養及菌落計數等操作。完成市售發酵飲料產品中乳酸菌的檢測，對市售發酵奶制品中乳酸菌的活菌含量有所了解。

1.2儀器與試劑

材料：供試發酵奶制品，市售益生菌飲料均可。

儀器：滅菌鍋、恒溫振蕩搖床、培養箱、天平、均質器、恒溫水浴箱、移液槍及配套槍頭、500 mL錐形瓶、培養皿、菌落計數器、放大鏡、具塞試管和接種環等。

1.3實驗步驟及內容設計

1.3.1樣品稀釋

(1)在超凈工作臺內，以無菌移液器移取25 mL樣品置于已滅菌的盛有225 mL生理鹽水的錐形瓶中(瓶內預裝一定數目的無菌玻珠)，搖勻，得到1∶10的樣品稀釋勻液。

(2)用移液器移取1 mL已稀釋成1∶10的樣品勻液，沿管壁緩緩注入已滅菌的盛有9 mL稀釋液的試管中(注意吸頭尖端避免觸及液面)，搖勻，得到1∶100的樣品稀釋勻液。

(3)依照以上操作步驟，制備一系列10倍梯度的稀釋樣品勻液，每遞增稀釋一次均更換無菌吸頭。

1.3.2乳酸菌總數測定

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是可發酵利用糖類，并產生大量乳酸的一類細菌的通稱。國標中檢測的乳酸菌主要有雙歧桿菌 (Bifidobacterium) 、嗜熱鏈球菌 (Streptococcus) 和乳桿菌 (Lactobacillus)。

(1)雙歧桿菌的計數。依據對待檢樣品中雙歧桿菌可能含量的估計，選擇連續的3個稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內，每個稀釋度做2個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至48 ℃的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良的MRS培養基傾注入平皿約15 mL，轉動平皿使混合均勻。在36 ℃下厭氧培養72 h后，對平板上的所有菌落進行計數。樣品稀釋和平板傾注的整個過程須在15 min內完成。

(2)嗜熱鏈球菌的計數。依據對待檢樣品中嗜熱鏈球菌可能含量的估計，選擇連續的3個稀釋度，分別吸取每一個稀釋度的樣品勻液1 mL置已于滅菌的平皿內，每一個稀釋度均做2個平皿做為平行。先將稀釋液加入平皿，再將已冷卻至48 ℃的MC培養基約15 mL傾注進平皿內，平行轉動平皿使稀釋液與培養基混合均勻。在36 ℃下需氧培養72 h后計數。在MC瓊脂平板上，嗜熱鏈球菌的菌落特征是菌落為中等偏小的紅色菌落，邊緣整齊光滑，直徑(2± 1 mm)，菌落背面呈現粉紅色。樣品稀釋和平板傾注的整個過程須在15 min內完成。

(3)乳桿菌的計數。依據對待檢樣品中乳桿菌可能含量的估計，選擇連續的3個稀釋度，分別吸取每一個稀釋度的樣品勻液1 mL置已于滅菌的平皿內，每一個稀釋度均做2個平皿做為平行。先將稀釋液加入平皿，再將已冷卻至48 ℃的MRS瓊脂培養基約15 mL傾注進平皿內，平行轉動平皿使稀釋液與培養基混合均勻。(36 ± 1)℃厭氧培養(72 ± 2)h。樣品稀釋和平板傾注的整個過程須在15 min內完成[6]。

1.4實驗結果

菌落計數以菌落形成單位(CFU)表示，可用肉眼或放大鏡觀察，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。

選取菌落數為30～300 CFU且菌落無蔓延生長的平板用于菌落總數計數。<30 CFU的平板可計算具體菌落個數，>300 CFU的平板可記錄成“多不可計”。每一個稀釋度的菌落總數需選取2個平板計數結果的平均值，再將此平均值乘以相應的稀釋倍數，即為每g(mL)待測樣品中菌落總數。如圖1所示，2個平板稀釋倍數均為10-7，則市售乳飲料中干酪乳桿菌的數量為1.3×109CFUmL。

如果連續2個稀釋度的平板上菌落總量在適宜計數范圍內，按式(1)計算。

(1)

式中N——待測樣品中菌落總數

∑C——含適宜范圍菌落數平板上的菌落數總和

n1——低稀釋倍數的平板個數

n2——高稀釋倍數的平板個數

d——稀釋因子即低稀釋倍數的稀釋度

圖2為市售飲料中嗜熱鏈球菌平板計數實例，其中，平皿A稀釋倍數10-5，平皿B稀釋倍數10-6，則該市售飲料中嗜熱鏈球菌數量為2.8×107CFUmL。

2 實驗實施過程及時間安排

該綜合型探索性實驗過程分為3個階段。

第1階段：課前開展討論并確定實驗方案。教師在開始授課前2周布置實驗項目，將項目名稱、實驗目的和意義、注意事項等發給學生。學生2人為一組，要求每個學生都要通過各種途徑查閱文獻資料，自行進行分析討論，結合文獻資料和已學過的實驗操作初步確定實驗方案，課前1周由教師組織課堂討論，教師按照實驗的可行性和準確性等要求對方案進行審查，并指出方案中存在的問題，學生進一步修訂方案，教師課前檢查并確定實驗最終方案[7]。

第2階段：實驗實施過程。各小組根據已確定的實驗方案，在現有實驗室條件下開展實驗。小組學生在實驗過程中需相互合作，遇到困難時，小組學生先進行討論并提出解決辦法，再尋求教師幫助。在整個實驗過程中，約3名教師隨堂巡視，每位教師負責學生8～12人，規范學生的實驗操作手法，避免或減少因實驗操作不當而造成的人為誤差，以提高實驗結果的可靠性[8]。

第3階段：實驗結果總結與分析。實驗完成后，學生觀察實驗結果，分析實驗結果是否達到預期，并分析整個實驗過程，總結經驗教訓，分析成敗關鍵環節及實驗操作要點，完成實驗報告，教師按照對應的考核評價標準給出分數。

3 考核評價標準

實驗課總成績為100分，成績組成和比例與傳統驗證性實驗項目不同，進行了重新規劃。其中，學習態度及團隊合作占20%，實驗操作占40%，實驗報告占40%。學習態度及團隊合作主要考察學生主動性、遵守微生物學實驗室守則、按時提交預習報告和實驗方案及實驗過程中積極配合和團結協助情況。實驗操作主要考察學生微生物學的基本操作技能，以及有關儀器設備的正確使用，由教師根據操作情況給予課堂評分[9-10]。實驗報告內容及分值進一步細化到實驗目的、實驗原理概述、材料和儀器、實驗內容及步驟、結果分析與討論和思考題，其中，結果分析及思考題部分的分值占實驗報告的50%。此評價方式更注重過程管理和側重實驗結果分析與學生的討論思考環節，督促學生關注課前討論、課上操作和課后分析的全過程。探索性實驗課程的實施培養了學生的團隊協作精神，訓練學生設計、歸納并總結，提倡討論與思考，學生發現問題、分析并解決問題的能力在此過程中得到較好的鍛煉。

4 結束語

“發酵奶制品中益生菌的檢測”實驗項目所需時間不長且儀器設備簡單，在本科實驗教學中可以實現。該實驗項目緊跟生活熱點，在生產中應用廣泛，學生非常感興趣。通過把綜合型探索性實驗項目引入食品微生物學實驗課，把傳統的“以課程為中心”實驗教學內容轉移到“以問題為中心”的軌道上，學生通過探索性實驗可以將理論課所學的知識點和實驗課的操作單元有機結合，知識掌握更加深入和系統，鍛煉本科生查閱文獻和運用已掌握的食品微生物學基礎知識及實操技能來解決生產實際問題的能力，使其能在未來的職業生涯中盡快適應社會。