載花青素微膠囊的制備及其抗氧化性能

李星宇，劉 港，高逸飛，郭慶中，吳江渝，鄭華明

武漢工程大學材料科學與工程學院，湖北 武漢 430205

花青素（anthocyanin，Cy）又名花色素，是一種水溶性天然色素，廣泛存在于自然界的各種植物中［1］。目前已知的Cy 有20 多種，如矢車菊素、飛燕草素、牽牛Cy 等。Cy 具有非常強的抗氧化清除自由基的能力，并且作為一種食品添加劑，不僅沒有傳統食品添加劑的副作用，而且還能軟化血管，降低血糖，具有一定的保健功能［2］。但是，Cy 在具有抗氧化性的同時，自身難免易于被空氣中的氧氣氧化導致活性降低，為了能夠提高Cy 的穩定性，利用微膠囊技術對Cy 進行包封是一種很好的途徑。

多糖、蛋白質作為天然高分子材料，無毒、易降解，已成為制備微膠囊最廣泛使用的壁材［3］。Rutz 等［4］以殼聚糖和果膠為壁材，采用復凝聚法制備了棕櫚油微膠囊，在酸乳的生產上得到了很好的應用。Yuan 等［5］以大豆分離蛋白和殼聚糖為原料制備了包封海藻油的微膠囊，發現殼聚糖有助于提高海藻油的包封率和抗氧化穩定性。Svanberg 等［6］以乳清分離蛋白為乳化劑，在越桔油的乳液中加入Cy，發現Cy 對脂肪的氧化具有極強的保護作用。

本文采用天然高分子材料海藻酸鈉和殼聚糖對Cy 進行包封，控制氯化鈣、海藻酸鈉、殼聚糖的質量分數，制備了海藻酸鈉-殼聚糖載花青素微膠囊（anthocyanin-loaded microcapsules，CyMCs），分析了CyMCs 的包封率、抗氧化性及形貌特性等。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

海藻酸鈉（Medium viscosity）、殼聚糖（low viscosity）（sigma-aldrich 公司）；Cy（純度為25%，以矢車菊-3-葡萄糖苷計），自提取；大孔樹脂（AB-8，北京索萊寶科技有限公司）；其它用于實驗的試劑（分析純，國藥集團試劑有限公司）。

紫外分光光度計（Lambda35，Perkin Elmer），冷凍干燥機（Alpha1-4Dplus，Christ 公司），恒流泵（BT-100-4，上海青浦滬西儀器廠），傅里葉變換紅外光譜儀（L1600301，Perkin Elmer）。

1.2 實驗方法

1.2.1 微膠囊的制備 取一定量的海藻酸鈉和殼聚糖分別加入到去離子水和醋酸水溶液（體積分數1.0%）中，室溫條件下，600 r/min 磁力攪拌2 h，得到透明黏稠狀溶液，于4 ℃冰箱儲存24 h，備用。將一定量的氯化鈣加入殼聚糖的醋酸溶液中，攪拌使氯化鈣完全溶解。將海藻酸鈉溶液經恒流泵通過25G（內徑為0.26 mm）的針頭，維持針頭與液面距離為10 cm，逐滴滴入到殼聚糖/氯化鈣溶液中，磁力攪拌（400 r/min）反應30 min，使微膠囊固化成型。布氏漏斗過濾后，冷凍干燥，得到海藻酸鈉-殼聚糖空白微膠囊（blank microcapsules，BMCs）；取一定量的Cy 溶于海藻酸鈉溶液中，攪拌使其分散均勻，制備過程與BMCs 相同，得到海藻酸鈉-殼聚糖CyMCs。

1.2.2 材料表征 將樣品在105 ℃真空干燥箱中干燥24 h，用溴化鉀壓片進行傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）分析。

1.2.3 CyMCs 包封率的測定 采用間接測量法［7］，測量未包封的Cy 含量來計算微膠囊的包封率。取制備CyMCs 時的濾液，將其pH 值分別調節至1.0和4.5，在λmax=524 nm 和λ=700 nm 時測吸光度值，根據標準曲線擬合方程y=0.014 6x+0.008 9（x 為Cy 的質量濃度，μg/mL；R2=0.999 02）計算包封率。1.2.4 CyMCs 的抗氧化性測定 配制硫酸亞鐵溶液（9.0 mmol/L）、乙醇-水楊酸溶液（9.0 mmol/L）和過氧化氫溶液（8.8 mmol/L）。采用水楊酸法［8］測定包封率最佳條件下的CyMCs 對羥基自由基的清除效果。

2 結果與討論

2.1 FT-IR 分析

圖1 是BMCs，Cy 及CyMCs 的FT-IR 圖。由BMCs 的譜線可 見，3 447 cm-1處 是-OH 和-NH2的伸縮振動峰，2 919 cm-1和2 850 cm-1處是-CH和-CH2的伸縮振動峰（此圖中省略），1 629 cm-1處是殼聚糖的-NH3+（1 651 cm-1）與海藻酸鈉的-COO-（1 613 cm-1）通過靜電吸附作用所產生的吸收峰［9］；在Cy 的譜線中，1 516 cm-1處是Cy 的B環上2 個-OH 伸縮振動峰，由此可見紫甘藍富含矢車菊素［10］，1 630 cm-1和1 454cm-1處是Cy 苯環中的C＝C 伸縮振動［11-12］，1 075 cm-1處是Cy 的C 環中C-O-C 的特征吸收峰［12］；在CyMCs 的譜線中，可以看到不僅海藻酸鈉和殼聚糖對應的吸收峰沒有消失，而且還保留了Cy 在1 454 cm-1處的特征吸收峰，說明Cy 被成功包封且未與壁材發生反應。

圖1 BMCs、Cy 和CyMCs 的FT-IR 圖Fig.1 FT-IR spectra of BMCs，Cy and CyMCs

2.2 影響CyMCs 包封率的因素

2.2.1 海藻酸鈉質量分數對包封率的影響 保持殼聚糖質量分數為0.5%，氯化鈣質量分數為3%，Cy 加入量為10 mg，攪拌溫度為35 ℃，攪拌速率為300 r/min，海藻酸鈉的質量分數為0.6%，0.8%，1.0%，1.2%和1.4%的條件下制備微膠囊，并測定其包封率，如圖2（a）所示。

圖2 不同因素質量分數對包封率的影響：（a）海藻酸鈉，（b）氯化鈣，（c）殼聚糖Fig.2 Effects of different mass fractions on encapsulation efficiency：（a）alginate，（b）calcium chloride，（c）chitosan

由圖2（a）可以看出，當海藻酸鈉的質量分數由0.6%增加到1.0%時，包封率相應地從78.8%增加到93%。其原因可能是隨著海藻酸鈉質量分數的增加，與殼聚糖反應機率上升，形成的微膠囊變得緊實，有利于Cy 的包埋。同時，當Cy 海藻酸鈉溶液黏度增加時，增大了溶液對Cy 的束縛作用，使得Cy 流失減少；繼續增大海藻酸鈉的質量分數，此時參與反應的氯化鈣和殼聚糖相對不足，所制備的微膠囊結構比較蓬松而且多孔，容易破裂，在成型過程中造成Cy 過多流失［13］，導致包封率從93%下降到84%。同時，當海藻酸鈉質量分數過高時，容易造成Cy 海藻酸鈉溶液體系黏度過大，不利于與殼聚糖和氯化鈣進行反應，導致包封率降低［14］。

2.2.2 氯化鈣質量分數對包封率的影響 鈣離子作為一種螯合劑，其原子直徑為1.14×10-10m，可以與海藻酸鈉分子中的古羅糖醛酸殘基在海藻酸鈉基質內部形成二維的鍵合結構［15］。當鈣離子質量分數較小時，可以形成絮狀的無規結構，當鈣離子質量分數過高時，可以形成凝膠。實驗過程中，保持海藻酸鈉質量分數為1.0%，殼聚糖質量分數為0.5%，Cy 添加量為10 mg，攪拌溫度為35 ℃，攪拌速率為300 r/min，在氯化鈣質量分數為0.25%，0.5%，1.0%，2.0%，3.0%，4.0%和5.0%的條件下制備微膠囊，測定微膠囊的包封率，如圖2（b）所示。

由圖2（b）可知，當氯化鈣質量分數較低時，與海藻酸鈉形成的絡合點較少，此時雖能成球狀微膠囊，但是微膠囊的機械強度偏小，在攪拌和干燥過程中微膠囊容易破裂，導致Cy 的包封率普遍不高；然而，當氯化鈣的質量分數從1%增加到5%時，其包封率從97%下降到67%。其原因可能是溶液中的鈣離子與海藻酸鈉絡合的位點越多，形成的海藻酸鈣微膠囊的結構越緊密，球形度越好。同時，微膠囊內部空腔的體積也會減小，對微膠囊內部的Cy 溶液形成一定的擠壓，導致包封的Cy 被排斥，造成包封率偏低［15］。通過鈣離子滴定實驗發現，鈣離子始終處于過量，不能完全參與海藻酸鈉與鈣離子的絡合反應，因此海藻酸鈣微膠囊的包封率與鈣離子的質量無關，只與鈣離子的質量分數存在一定的關聯。

2.2.3 殼聚糖質量分數對包封率的影響 保持海藻酸鈉質量分數為1.0%，氯化鈣質量分數為1.0%，Cy 添加量為10 mg，攪拌溫度為35 ℃，攪拌速率為300 r/min，在殼聚糖質量分數為0.1%，0.3%，0.5%，0.7%和0.9%的條件下制備微膠囊，并測定其包封率，如圖2（c）所示。

由圖2（c）可知，當殼聚糖質量分數低于0.7%時，體系中可參與反應的殼聚糖處于不飽和狀態，此階段中隨著殼聚糖質量分數的增大，更多的與海藻酸鈉的-COO-結合，微膠囊壁逐漸變厚，強度增加，使其包封率增加。此后，再增加殼聚糖的質量分數，會有部分殼聚糖分子進入到微膠囊的內部，形成更多的交聯點［13］，此時微膠囊的機械強度會有一些增加，但是對Cy的包封會出現不利影響。

2.3 CyMCs 的抗氧化特性

取在海藻酸鈉質量分數為1.0%，氯化鈣質量分數為1.0%，殼聚糖質量分數為0.5%的條件下制備的最佳包封率的CyMCs 進行抗氧化實驗，制備樣品的包封率為97.42%，載藥率為5.4%。CyMCs對羥基自由基的清除率如圖3 所示。

圖3 CyMCs 對羥基自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of hydroxyl radical by CyMCs

由圖3 可以看出，CyMCs 對羥基自由基存在清除作用，且隨著CyMCs 的質量濃度增加，對羥基自由基的清除效果也不斷增強，通過擬合曲線y=0.530x+4.127（x 為CyMCs 的質量濃度，μg/mL；R2=0.996）計算得出CyMCs 對羥基自由基的半數清除質量濃度為84 μg/mL。由此可見，實驗中所制備的CyMsC 對羥基自由基的清除能力明顯要優于食品工業中常用的抗氧化劑抗壞血酸（半數清除質量濃度為622.3 μg/mL）［16］。

2.4 形貌分析

CyMCs 的形貌如圖4 所示。由圖4 可以看出，CyMCs 與無色透明的空白微膠囊相比，具有鮮艷的色澤，說明微膠囊對Cy 成功進行了包封；從形貌上看，制備的CyMCs 呈球形，表面光滑，大小均一。在濕態情況下，微膠囊的直徑約為3 mm；在干態情況下，微膠囊的直徑約為1.3 mm。冷凍干燥后的CyMCs 有所收縮，表面變得有些粗糙，其原因是海藻酸鈉和殼聚糖聚電解質復合膜形成了不規則的纖維化表面［17］。但囊壁結構維持完整，保持了一定的機械強度，實現了微膠囊對Cy 的包封。

圖4 CyMCs 微膠囊的形貌：（a）濕態，（b）凍干后Fig.4 Morphologies of CyMCs：（a）wet state，（b）after freeze-drying

3 結 論

利用微膠囊技術對Cy 成功進行了包封，通過單因素實驗，確定在海藻酸鈉質量分數為1.0%，氯化鈣質量分數為1.0%，殼聚糖質量分數為0.5%時，制備的CyMCs 包封率最高可達97.42%；對CyMCs 進行了抗氧化性實驗表明，CyMCs 對羥基自由基清除率達50%時的質量濃度為84 μg/mL。將Cy 微囊化達到了提高Cy 穩定性的目的，可延長易氧化食品的保質期。