白菜花器官脫落過程的BcAZPG1表達研究

韋俊濤，陳凌云

（浙江農林大學農業與食品科學學院，杭州 310000）

在自然界中，植物細胞的生長受動態平衡的調節[1，2]，脫落是植物脫落多余器官的過程。離區發育是植物完成生活周期的重要組成部分，精確調控的細胞分離是離區發育的重要特征之一，果膠是細胞壁多糖的重要組成成分，其降解在離區發育中起到重要作用[3.4]。植物細胞壁的果膠降解涉及一系列酶的參與，包括多聚半乳糖醛酸酶（PGs）、果膠甲酯酶（PMEs）以及果膠裂解酶（PLLs）等[5]。已有證據表明，PG在擬南芥、番茄、油菜等多個物種的花、果莢、葉和果實等器官的離區發育過程中起到非常重要的作用。通過對離區相關發育的PG基因的功能發揮作用，能夠更好的認識離區發育的分子機理以及多糖代謝的過程，對于蔬菜等農作物的產量、品質等農藝性狀的了解有更重要的發展意義和實踐醫用價值，為今后更好的育種和栽培提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以與白菜同一亞種的‘油青四九’菜心自交系為材料（該材料只要55d即可完成整個生育周期）供轉基因驗證基因功能使用。采用啟動子同和表達載體侵染哥倫比亞野生型的擬南芥的方法進行轉化對比驗證，以獲得所需目標轉基因植株。

1.2 RNA的提取及反轉錄

用Trizol法提取植物RNA，通過以下方法來檢測：將電泳槽、錐形瓶、膠板、制膠用的梳子用清水清洗干凈，用75%酒精浸泡3h以上，并用保鮮膜將其包牢，倒掉酒精晾干備用。重新稀釋TAE緩沖液1L，注入電泳槽，并用新稀釋的TAE緩沖液制備1%的瓊脂糖凝膠，凝固后備用。取1.2μgRNA樣品放入進口的PCR管中，加入8μL RNA Loading Buffer，并用0.1%的DEPC水補足至12μL，混勻后放在PCR儀中65℃變性5min。迅速置于冰上，點樣，120V電泳15min。用凝膠成像儀觀察電泳結果。質量好的RNA條帶清晰，無拖尾現象，并且28S條帶與18S條帶亮度比值接近2:1，最后反轉錄成cDNA作模板。

圖1 白菜RNA提取結果，文中所有構建載體以此為模板Fig1 RNA extraction results from Brassica rapa,All constructed vectors in this paper used this as template.

1.3 構建啟動子GUS報告基因的載體侵染擬南芥

利用獲得的Bra027210基因序列，定位到白菜數據庫中，根據轉錄方向尋找到該基因上游1500～2000bp核苷酸處，設計兩對引物，引物為p027210-4Fp和p027210-4Rp（見表1），用KOD酶PCR擴增Bra027210基因序列，經過測序驗證后進行大腸桿菌的轉化與質粒的提取，隨后用凍融法轉化農桿菌GV3101，獲得目標載體菌液。最后通過農桿菌介導啟動子-GUS融合表達載體轉化擬南芥的方法{6}來獲得擬南芥T1代種子，隨后通過無菌培養的方法篩選出所需轉基因材料（如圖2）。

表1 試驗中設計的引物序列Table 1 Primer Sequence used in this study

圖2 擬南芥侵染篩選過程Fig2-The screening process of Arabidopsis thaliana infection

1.4 Bra027210啟動子表達載體的擬南芥表達分析

在哥倫比亞野生型擬南芥中，用侵染的方法將Bra027210啟動子表達載體導入，然后經過篩選出來的T1代，用特異物對為35S-PBI121-Fp和W-p027210-Rp來檢測和篩選出陽性T1代單株，等到其生長至盛花期，用上述引物繼續驗證兵對不同組織器官進行GUS染色分析。GUS染色分析的方法如下：配制GUS染液（1.9 mmol·L-1 X-Gluc(Sangon,CN),20%methanol,0.5 mmol·L-1 potassium ferricyanide,0.5 mmol·L-1 potassium ferrocyanide,和 0.3%Triton X-100 in 0.2 mol·L-1 sodium phosphate buffer(pH 7.0)）后，取500μl染色液到1.5 ml離心管中，將陽性單株的整簇花序在染液中浸沒后，37℃放置24-36h后，用體式顯微鏡觀察和拍照。

2 結果與分析

2.1 啟動子的克隆及融合表載體的構建

將用特異引物p027210-4Fp和p027210-4Rp擴增得到的Bra027210的全長CDS序列，全長約2000bp左右，用菜心提取的DNA作為模板，經入門載體連接和LR反應后，經35S-PBI121-Fp.和35S-PBI121-Rp檢測，膠圖結果（圖3）與預定長度相符合，將該啟動子片段與經過雙酶切（HindIII/XbaI）的線性載體PBI101，通過同源重組的方式獲得的菌液檢測結果（圖3下右邊）顯示1-9號菌液與數據庫序列匹配，經測序成功的菌液轉化農桿菌后侵染擬南芥花序,用GUS染色的方式來驗證其在模式植物擬南芥中的表達部位，從而確定其是否是真正控制白菜花瓣脫落的主導因子。

圖3 Bra027210啟動子目的片段、質粒及載體擴增結果Fig3 Amplification ofBra027210promoter target fragment,plasmid and vector

2.2 白菜花脫落相關PG基因的表達模式分析

擬南芥已成功地被用作研究植物一系列發育過程的模型系統，但很少有人對擬南芥的脫落進行研究。這主要是因為這種植物不會脫落它的葉子和失去的組織（萼片、花瓣和花藥）為生化或分子分析提供了少量的離區材料。將構建好的載體用侵染方法轉化到哥倫比亞野生型擬南芥中，對其進行篩選得到T1的單株，用設計的特異引物35S-PBI121-Fp和W-p027210-Rp進行驗證（圖4）。對p027210-PBI121載體的轉基因擬南芥T1代單株在盛花期與落花期之間取一簇花序進行GUS染色分析結果表明，Bra027210的啟動子能夠特異的在花脫落時期啟動基因的表達，它能在花脫落的特定部位表達（圖5），說明Bra027210為一個在花脫落期發揮作用的多聚半乳糖醛酸酶基因。

圖4 Bra027210啟動子載體轉基因擬南芥陽性檢測結果Fig4 The test results of Bra027210promoter vector transgenic arabidopsis positive

圖5 Bra027210啟動子載體在擬南芥中的表達情況Fig5 Bra027210Promoter Vector Expression in Arabidopsis

3 結論與討論

為了解Bra027210基因表達的調控作用和進一步分析其表達模式，后期我們還可以通過PCR擴增對其進行檢測驗證。同時我們可以在后期實驗中通過亞細胞定位在洋蔥表皮細胞中看該基因的瞬時表達情況，來判斷Bra027210是否是一個有功能的啟動子，從而說明Bra027210的啟動子可能是一個花脫落期間的特異啟動子。本文用GUS染色的方法來驗證啟動子融合表達載體p027210-PBI121：GUS的轉基因擬南芥植株，分析研究表明，GUS能夠在特定的花器官脫落的時期在特定的部位有表達信號。進一步分析結果表明，它主要在花瓣的脫落部位特定表達，而不是在葉片、花瓣、根等其他部位表達。用一個普通野生型擬南芥也進行GUS染色對比，發現沒有任何的GUS信號，更是充分證明了該啟動子基因在花（器官）脫落中發揮了重要作用。