背部推拿手法對亞急性衰老并免疫功能低下家兔血清免疫細(xì)胞與免疫球蛋白的影響研究?

王之虹，楊寄禹，劉明軍，卓 越，楊寄渝，于明超，尚 坤，張 欣

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

宋代醫(yī)學(xué)著作《圣濟(jì)總錄》中記載推拿按摩可以“斡旋氣機(jī)，周流營衛(wèi)、宣搖百關(guān)、疏通凝滯”，能夠使人“耳目聰明，身體輕強(qiáng)，老者復(fù)壯，壯者復(fù)治”[1]。項目組據(jù)此提出“推拿手法能夠改善機(jī)體免疫功能”的說法，以亞急性衰老并免疫功能低下的家兔模型為研究對象，以背部推拿手法為干預(yù)手段，通過觀察家兔體質(zhì)量、血清免疫細(xì)胞與免疫球蛋白的變化情況加以驗證，獲得滿意結(jié)論。

1 材料

1.1 實驗動物

純種新西蘭大耳家兔36只(長春中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(吉)2016-0004)，兔齡4個月，體質(zhì)量(1950±210)g。采用隨機(jī)數(shù)字表法將家兔分為空白組、模型組、藥物組、推拿組4組。其中空白組、模型組家兔各6只，藥物組、推拿組家兔各12只。所有家兔分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)房間光線充足、通風(fēng)良好，溫度保持在18～25 ℃左右，相對濕度保持在50%～70%左右。本實驗已通過長春中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查。

1.2 實驗藥品

環(huán)磷酰胺注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H32020857)；免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)、酶聯(lián)免疫試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號ML027242、ML027243)；補(bǔ)體3(Complement 3，C3)、補(bǔ)體4(Complement 4，C4)酶聯(lián)免疫試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號ML027351、ML027854)；免疫細(xì)胞分化簇3(cluster of differentiation，CD3+)、輔助性T細(xì)胞(cluster of differentiation 4，CD4+)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cluster of differentiation 8，CD8+)、自然殺傷細(xì)胞(atural killer cell，NK)酶聯(lián)免疫試劑盒(美國貝克曼庫爾特商貿(mào)中國有限公司，貨號ML773220、ML762221、ML774302、ML778201)。

1.3 實驗儀器

推拿手法測定儀(上海益聯(lián)醫(yī)學(xué)發(fā)展有限公司，TAP-Ⅱ型)；血細(xì)胞檢測儀(i-STAT300型，美國雅培公司)；低速離心機(jī)(TL80-1型，江蘇天力醫(yī)療器械有限公司)；酶標(biāo)儀(SM600型，上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司)；體液免疫檢測儀(DXI 800型，美國貝克曼公司)。

2 方法

2.1 動物模型的制備

采用環(huán)磷酰胺腹腔注射的方法造模。以60 mg/(kg.d)的標(biāo)準(zhǔn)計算每日注射量，連續(xù)開展腹腔注射4次，隔日注射1次。空白組注射等量生理鹽水。造模結(jié)束后，動物出現(xiàn)精神狀態(tài)差、飲食少、脫毛、眼屎、鼻腔分泌物增多、體質(zhì)量下降等現(xiàn)象，表明造模成功。

2.2 動物模型的處理

空白組動物每天抓取1次，不做其他處理。模型組、推拿組、藥物組動物每天抓取1次，隔日給予腹腔注射造模。造模結(jié)束第2天，推拿組動物開始推拿干預(yù)，藥物組動物開始口飼藥物。推拿和服藥時家兔不固定以避免驚嚇。

2.3 干預(yù)方法

2.3.1 背部推拿手法干預(yù) 推拿部位：實驗動物背部足太陽膀胱經(jīng)循行路線，肺俞穴至腎俞穴間部分[2]。

操作方法：直推法：術(shù)者一手扶持家兔，另一手拇食指分別置于家兔脊柱兩側(cè)，從頭至尾的方向進(jìn)行推法操作。操作時手指指腹緊貼局部皮膚，推進(jìn)速度適中，手法力度經(jīng)推拿手法測試儀測定約為0.5 kg，時間約3 min；按揉法：術(shù)者一手扶持家兔，另一手拇指置于脊柱一側(cè)，指腹著力，從頭至尾的方向進(jìn)行按揉法操作，重點(diǎn)按揉肺俞穴、心俞穴、肝俞穴、脾俞穴、腎俞穴。操作時指腹緊貼局部皮膚，順時針方向，揉動速度適中，手法力度經(jīng)推拿手法測試儀測定約為0.5 kg，時間約5 min；捏脊法：助手固定家兔，術(shù)者以雙手拇食指指腹部提捏家兔脊柱兩側(cè)皮毛及皮下組織，從尾至頭的方向進(jìn)行捏脊法操作。操作時移動速度適中，提捏力度經(jīng)推拿手法測試儀測定約為0.5 kg，反復(fù)操作10次。背部推拿手法干預(yù)每天1次，每次約10 min左右，連續(xù)干預(yù)21 d。

2.3.2 藥物干預(yù) 干預(yù)藥物黃芪精口服液(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z32021206)。干預(yù)方法：口飼劑量為30 g/kg·d，連續(xù)口飼21 d。

2.4 觀察指標(biāo)及方法

2.4.1 觀察指標(biāo) 觀察不同組別實驗動物干預(yù)前后體質(zhì)量差值，觀察不同組別實驗動物血清免疫細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+、NK含量，觀察不同組別實驗動物的外周血IgM、IgG含量。

2.4.2 檢測方法 分別于干預(yù)前后稱取實驗動物體質(zhì)量。干預(yù)結(jié)束后第2天麻醉實驗動物，耳緣靜脈取血，一部分血液抗凝、離心，取血清以酶聯(lián)免疫吸附法測定血清CD3+、CD4+、CD8+、NK含量。另一部分血液抗凝，采用免疫檢測儀檢測 IgM、IgG含量。

3 結(jié)果

3.1 不同組別實驗動物干預(yù)前后體質(zhì)量差值

表1示，推拿組和藥物組家兔在干預(yù)前后的體質(zhì)量差值均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同組別實驗動物干預(yù)前后體質(zhì)量差值影響比較

注：與空白組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較：★P<0.05

3.2 不同組別實驗動物血清免疫細(xì)胞含量

表2示，推拿組與藥物組家兔在干預(yù)后的血清免疫細(xì)胞CD3+、CD4+、NK的含量均高于模型組，CD8+的含量均低于模型組，其中CD3+、NK、CD8+含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

表2 不同組別實驗動物血清免疫細(xì)胞含量比較

注：與空白組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較：★P<0.05，★★P<0.01

3.3 實驗動物干預(yù)前后外周血IgM、IgG含量比較

表3示，推拿組與藥物組家兔在干預(yù)后的外周血IgM、IgG含量均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表3 不同組別實驗動物外周血IgM、IgG含量比較

注：與空白組比較：▲▲P<0.01；與模型組比較：★P<0.05，★★P<0.01

4 討論

背部推拿手法是項目組結(jié)合臨床工作經(jīng)驗與經(jīng)典醫(yī)籍發(fā)掘成果總結(jié)提煉形成，通過在機(jī)體背部足太陽膀胱經(jīng)循行部位開展推法、按揉法、捏脊法等推拿手法操作，達(dá)到疏通經(jīng)絡(luò)、行氣活血、調(diào)和營衛(wèi)、固表衛(wèi)外等目的，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用[3]。從中醫(yī)理論講，足太陽膀胱經(jīng)“主人體一身之表”，具有密肌固表的功效；其循行路線上分布的肝俞、心俞、脾俞、肺俞、腎俞等背俞穴也具有調(diào)節(jié)五臟功能、平衡機(jī)體陰陽的作用。同時，足太陽膀胱經(jīng)在十二經(jīng)脈中分布最長最廣，是人體的“藩籬”。太陽為諸陽之首，在三陽經(jīng)中陽氣最盛，陽氣充足，人體抵抗外邪的能力就強(qiáng)，換言之機(jī)體免疫功能增強(qiáng)[4]。

通過本研究的結(jié)果可見，背部推拿手法增加了免疫抑制家兔干預(yù)前后體質(zhì)量差值，表明有效改善了其身體狀態(tài)，側(cè)面證實背部推拿手法對免疫功能的調(diào)節(jié)作用。同時，背部推拿手法能夠有效增加免疫抑制家兔CD3+、CD4+、NK含量，降低CD8+含量，增加外周血IgM、IgG含量，直接證實背部推拿手法對免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

血清免疫細(xì)胞是機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答的重要基礎(chǔ)之一，其中CD3+細(xì)胞是成熟淋巴細(xì)胞，也是細(xì)胞免疫中最主要的活性細(xì)胞，是構(gòu)成T細(xì)胞抗原受體的膜抗原，參與免疫信號向細(xì)胞內(nèi)的傳達(dá)；CD4+細(xì)胞是輔助性T細(xì)胞，主要作用是增強(qiáng)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染作用，調(diào)節(jié)其他T細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)B細(xì)胞分泌抗體以增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答[5]；CD8+細(xì)胞在特異性免疫反應(yīng)中起識別和呈遞抗原的重要作用，主要針對細(xì)胞毒效應(yīng)，發(fā)揮細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能；NK細(xì)胞是機(jī)體重要免疫細(xì)胞，是天然免疫和特異性體液免疫中的效應(yīng)細(xì)胞，可合成和分泌多種細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫強(qiáng)化和造血作用以及直接殺傷靶細(xì)胞，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面具有重要作用[6]。免疫球蛋白是存在于機(jī)體體液中的一類糖蛋白，由B細(xì)胞收到抗原刺激后分化生成，是介導(dǎo)機(jī)體體液免疫的主要效應(yīng)分子。IgM是機(jī)體首次發(fā)生免疫應(yīng)答時所產(chǎn)生的抗體，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中占有重要的免疫防御地位；IgG在體液內(nèi)含量很高，廣泛分布，在機(jī)體再次免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，是主要的抗體之一[7]。本研究藥物組采用的藥物黃芪具有健脾益氣、升陽舉陷、益衛(wèi)固表等功效，自古便有“補(bǔ)藥之長”說法[8]。本研究結(jié)果顯示，背部推拿手法對免疫抑制家兔免疫細(xì)胞CD3+、CD4+、NK和免疫球蛋白IgM的提升作用，略高于口飼黃芪精口服液，體現(xiàn)了良好的改善免疫功能作用。同時，背部推拿手法操作簡便、安全、舒適、無毒副作用，更凸顯了臨床推廣的優(yōu)勢。

綜合以上研究可見，背部推拿手法能夠改善和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，其可能的作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能來實現(xiàn)。本研究結(jié)論將為推拿療法的作用機(jī)制研究開辟新的思路與方法，也為推拿療法應(yīng)用于養(yǎng)生保健和養(yǎng)老康復(fù)等大健康產(chǎn)業(yè)奠定實驗室基礎(chǔ)。