白藜蘆醇對肌萎縮側索硬化癥轉基因小鼠的療效及機制

王鳳 陳星宇

(廈門大學附屬中山醫院，福建 廈門 361000)

肌萎縮側索硬化癥(ALS)是一種累及脊髓、腦干和皮質運動神經元的神經變性疾病〔1〕。臨床表現為進行性加重的無力、四肢及軀干肌肉萎縮，導致運動功能障礙甚至呼吸肌麻痹，患者多于3～5年內死亡〔2〕。世界流行病學調查結果顯示，美國有12 000～15 000例ALS，中國約有20萬例ALS〔3,4〕。ALS的發病原因復雜，給患者帶來“毀滅性”的影響。放射性損傷、環境因素、重金屬中毒、腫瘤、自體免疫等都可能成為患病因素。ALS涉及多種發病機制，目前主要包括氨基酸的興奮性毒性作用、遺傳假說、氧化應激、線粒體功能障礙、神經營養因子障礙、自身免疫機制、病毒感染、神經炎癥、蛋白清除障礙及軸突運動障礙等發病假說〔5,6〕。目前沒有能給ALS患者帶來實質性臨床獲益的治療方案，國際承認、且唯一通過美國食品藥物監督局批準治療ALS的藥物為Covis Pharma的谷氨酸釋放抑制劑利魯唑〔7〕和田邊三菱公司的自由基清除劑依達拉奉〔8〕，但以上藥物只能改善患者的生存質量，不能阻止ALS的發病進程。利魯唑雖然能輕微改善部分患者的功能和生存率，但是其價格昂貴整體受益較差；依達拉奉長期用藥出現的毒副作用也限制了它的應用。針對ALS的藥物開發情況不容樂觀，我國尚缺乏自主研發的ALS治療藥物。白藜蘆醇(Res)是多酚類化合物，已被證實可激活沉默信息調節因子2相關酶(SIRT)1且廣泛用于各種實驗中，是一種研究較多的SIRT1激動劑，它主要來源于蓼科植物的根莖中。Res具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗心血管疾病等廣泛有益作用。鑒于其抗氧化能力有神經保護的作用，近年來Res逐漸被應用于神經退行性疾病治療研究〔9～11〕。本實驗采用B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J轉基因ALS小鼠為研究對象，觀察Res對ALS小鼠的療效，并對其機制進行初步探索。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組給藥 12周齡的雄性轉基因雜合子小鼠 B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J(Stock No.002726)，平均體重(30±2)g；同窩野生型B6SJL小鼠(WT組)，平均體重(30±2)g，購于美國Jackson實驗室(Bar Harbor,ME USA 04609)。所有小鼠按照廣州中醫藥大學SPF級實驗動物飼養管理規程進行飼養〔實驗動物使用許可證號：SYXK (粵)2013-0001〕。房間溫度維持(23±3)℃，濕度為40%～70%，房間保持12 h晝夜節律，小鼠自由進食和飲水。實驗中所有操作遵循美國國立衛生研究院(NIH)及廣州中醫藥大學實驗動物倫理委員會的相關規定。40只12周齡雄性B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J轉基因小鼠被隨機分配到SOD1-G93A組、Res組(7.5 mg/kg、15.0 mg/kg、30.0 mg/kg)和利魯唑組(5 mg/kg)，每組8只。同窩出生的小鼠作為野生組(WT 組)。Res組每天灌胃給藥對應濃度的Res 2次；利魯唑組每天灌胃給藥利魯唑2次；WT 組和SOD1-G93A 組每天灌胃給藥同等劑量的生理鹽水2次。給藥3個月后采用爬桿實驗、轉棒實驗、抓力實驗和曠場實驗等行為學實驗評價各組肌肉力量及運動癥狀的改善效果。

1.2主要實驗試劑 丁基苯酞原料藥購買于Sigma公司，陽性對照藥利魯唑片購買于萬特制藥(海南)有限公司，3-硝基酪氨酸(NT)和8-羥基脫氧鳥苷(OHdG)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Abcam公司)，丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物有限公司)，核因子NF-E(Nrf)2和血紅素氧合酶(HO)1抗體(Santa Cruz公司)，Trizol(Invitrogen)，反轉錄試劑盒(Fermentas，K1622)，GT VisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒〔基因科技(上海)有限公司〕。其余試劑均購于Sigma公司。

1.3主要實驗儀器 動物稱量天平〔梅特勒-特利多儀器(上海)有限公司〕，倒置顯微鏡(Olympus IX71，日本)，石蠟切片機和石蠟包埋機(Leica，德國)，多功能酶標儀(BioTEK，美國)，自制爬桿裝置(長55 cm，直徑1 cm)，開放場裝置(PanLab，西班牙)，轉棒裝置(安徽正華儀器有限公司)，YLS-13A大小鼠抓力測定儀(山東省醫學科學院)，半干式轉膜儀和電泳裝置(BioRad，美國)，實時定量PCR儀(Thermo，美國)。

1.4方法

1.4.1行為學指標測定〔12〕爬竿實驗：采用自制長55 cm，直徑1 cm，頂端放置一個直徑3 cm小球，外表面纏繞2層紗布的爬桿裝置。垂直放置在小鼠籠中，將小鼠頭部朝下置于桿的頂部球上,讓其沿桿自然爬下,記錄小鼠前肢碰到桿底所需要的時間，測定時限120 s，小鼠不能持桿、完全自然下滑者或不能調頭者，記錄其爬桿時間為120 s，每只小鼠測量3次，每次間隔30 min。

曠場實驗：握住小鼠尾部1/3處輕放于曠場裝置(長×寬×高=50 cm × 50 cm × 40 cm)的正中央，使小鼠適應5 min后，利用自主攝影系統記錄小鼠的自發活動，連續記錄10 min，并用相關軟件分析處理數據，統計小鼠整個自主運動的總距離。鑒于動物的生活習性，實驗均在9∶00～12∶00 AM進行，每次實驗結束用70%的酒精擦拭曠場。

轉棒實驗：YSL-4C小鼠轉棒式疲勞儀設定起始轉速為5 r/min，轉速保持20 s后，依次增加5 r/min并保持20 s，最后加速到30 r/min，檢測時間共計3 min。手持小鼠尾部置于正在運轉的轉棒儀上，并開始計時，記錄小鼠在轉棒儀上停留的時間(即第一次掉落的時間)，每只小鼠測定3次，每次間隔1 h。數據用以評價小鼠四肢協調性和平衡性。

抓力實驗：YLS-13A小鼠抓力測定儀水平放置，使抓力板呈現水平運動，測量記錄小鼠后肢抓力值，每只小鼠測定3次，每次間隔30 min，取平均值作為統計以評價藥物對動物肢體力量影響程度。

1.4.2標本采集及相關指標測定 利用微量管牽拉儀牽拉玻璃毛細管(內徑為0.75 mm，外徑為1.0 mm)，在解剖顯微鏡下用鑷子打破尖銳毛細管的尖端，使破碎尖端的內徑為10～20 μm，將細管和注射器連接到毛細管支架的另一端，并用三通閥連接細管和注射器。小鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪〔(8.7+1.3)mg/100 g〕深度麻醉后，使用小鼠適配器固定小鼠頭部(頭后部朝上，鼻子指向約45°，使用剪刀和彎曲的鑷子，切開皮膚和分離第一層肌肉直到頭骨基部只露出一層薄薄的肌肉，并將這些肌肉層移到側面暴露硬腦膜(三角形狀，通常有1～2條大血管穿過該區域；或者血管的一側)，清潔后用干燥的棉花擦干該區域，抽取小鼠腦脊液；用1 ml注射器插入心臟抽取血液，放于1.5 ml離心管中，室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，吸取上清，分裝于-80℃保存備用。待所有標本采集完畢后，嚴格按照8-OHdG、3-NT和MDA檢測試劑盒相關說明對標本進行檢測。

1.4.3免疫染色運動神經元〔12〕小鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪〔(8.7+1.3)mg/100 g〕深度麻醉后，心臟灌注沖洗至流出的液體為無色，切取小鼠腰4～5段后迅速浸泡于4%多聚甲醛溶液中，隨后用梯度乙醇脫水，二甲苯透明后透蠟，包埋后連續切片脊髓為5 μm，進行后續染色。切片在65℃烤箱脫蠟1 h，經二甲苯和梯度乙醇溶液脫蠟復水后，放于0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH=6.0)中加熱煮沸，抗原修復10 min，自然冷卻后，放入3%H2O2溶液中避光反應10 min，去除內源性的過氧化物酶，10%胎牛血清封閉1 h后滴加Neuro N一抗(1∶200)4℃孵育過夜，PBS洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶200)，室溫孵育1 h；二氨基苯胺(DAB)工作液顯色，自來水終止顯色反應，梯度酒精脫水和二甲苯透明后用中性樹脂封片，最后，倒置熒光顯微鏡下拍照小鼠脊髓組織Neuro N染色陽性的運動神經元。

1.4.4Western印跡檢測〔13〕分離的各組小鼠脊髓組織，按照V/W(10 μl∶1 mg)加入含1 μg/ml PMSF和1 μl磷酸化酶抑制劑的RIPA緩沖液，冰上勻漿3 min后，4℃條件下12 000 r/min離心15 min，取上清，用Pierce BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。上樣30 μg蛋白，調節電壓至80 V，待溴酚蘭剛跑出分離膠底部即可終止電泳，然后將PAGE凝膠放于半干轉印槽，恒壓15 V條件下轉膜2 h，5%奶粉的封閉2 h，TBST緩沖液洗3次，每次5 min，加入抗體稀釋液稀釋至適當濃度的一抗(1∶1 000)，4℃條件下孵育過夜。TBST清洗后加入HRP標記的二抗(HRP-IgG，1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌后，加入ECL顯影液，在發光成像系統曝光顯影并利用該凝膠圖象處理系統分析其灰度值。

1.5統計學方法 采用GraphPad Prism5軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1Res對SOD1-G93A小鼠體重的影響 給藥前和給藥后每隔1個月稱量小鼠體重，計算各組給藥后相比給藥前的體重變化率。實驗結果顯示，給藥3個月后SOD1-G93A組體重并未明顯變化，而WT組體重明顯增加，兩者比較差異有顯著統計學意義(P<0.001)。利魯唑組相對SOD1-G93A組體重無明顯變化，而給藥劑量30 mg/kg 的Res組體重與SOD1-G93A組比較差異均有顯著統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組給藥后1～3個月體重變化率

與同時間點SOD1-G93A組比較：1)P<0.001；與同組給藥2個月比較：2)P<0.001；與同組給藥1個月比較：3)P<0.001；與同組給藥時比較：4)P<0.001

2.2Res顯著改善SOD1-G93A小鼠的運動行為學癥狀 SOD1-G93A小鼠肌肉萎縮無力，表現出明顯的行為學障礙。在爬桿實驗中，SOD1-G93As小鼠的爬桿時間顯著高于WT組(P<0.001)。Res給藥治療3個月后(除Res組7.5 mg/kg外)，小鼠的運動行為學障礙得到顯著改善，爬桿時間與SOD1-G93A組相比顯著降低，30.0 mg/kg Res組爬桿時間與利魯唑組相當。在轉棒實驗中，WT組平均潛伏期SOD1-G93A組相比差異有顯著統計學意義(P<0.001)，7.5、15.0和30.0 mg/kg Res治療后顯著增加小鼠在轉棒儀上的時間。在曠場實驗中，與WT組相比，SOD1-G93A組運動距離明顯下降(P<0.001)，不同給藥劑量的Res組可以顯著提高運動距離(P<0.05)。在抓力實驗中，與WT組相比，SOD1-G93A組抓力顯著下降(P<0.001)，15.0、30.0 mg/kg Res治療后顯著增加小鼠的后肢抓力(P<0.001)。見表2。

表2 各組給藥后運動行為比較

與WT組比較：1)P<0.001；與SOD1-G93A組比較：2)P<0.01；3)P<0.001；下表同

2.3Res顯著降低SOD1-G93A小鼠血清和腦脊液中3-NT和8-OHdG的含量 在血清和腦脊液標本中，與WT組相比，SOD1-G93A組3-NT和8-OHdG的含量明顯上升(P<0.001)，15.0、30.0 mg/kg Res組可顯著降低3-NT和8-OHdG的含量(P<0.001)。見表3。

表3 各組血清和腦脊液中8-OHdG和3-NT含量比較

2.4Res顯著降低SOD1-G93A小鼠血清和腦脊液中MDA的含量 在血清和腦脊液中，與WT組相比，SOD1-G93A組MDA含量明顯上升(P<0.001)，15.0、30.0 mg/kg Res治療后可顯著降低SOD1-G93A小鼠血清和腦脊液中MDA的含量，并且效果優于利魯唑組。見表4。

2.5Res顯著增加小鼠脊髓前角運動神經元數量 WT組、SOD-G93A組、7.5、15.0、30.0 mg/kg Res組和利魯唑組平均運動神經元數目分別為(19.1±0.67)、(8.4±1.01)、(10.0±0.98)、(13.4±1.05)、(16.4±0.76)和(14.9±1.06)個。與WT組相比，SOD1-G93A組脊髓前角運動神經元明顯減少(P<0.001)，病變的神經元逐漸出現核固縮，細胞邊界模糊不清和細胞體積減小。與SOD1-G93A組相比，15.0、30.0 mg/kg Res組脊髓前角的運動神經元顯著增多，胞體增大，未見明顯細胞核固縮現象。見圖1。

表4 各組血清和腦脊液中MDA含量比較

圖1 各組小鼠脊髓組織Neuro N陽性運動神經元免疫組化檢測(DAB，×50)

2.6Res顯著增加SOD1-G93A小鼠脊髓組織Nrf2和HO-1蛋白的表達 與WT組相比，SOD1-G93A小鼠脊髓組織Nrf2和HO-1的蛋白含量顯著降低(P<0.001)，7.5、15.0、30.0 mg/kg Res組可顯著增加Nrf2和HO-1的蛋白表達(P<0.01)。見圖2、表5。

1～6：WT組、SOD1-G93A組、7.5 mg/kg Res組、15.0 mg/kg Res組、30.0 mg/kg Res組、利魯唑組圖2 各組脊髓組織中Nrf2和HO-1的蛋白水平

表5 各組Nrf2和HO-1蛋白相對灰度值

3 討 論

B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J轉基因小鼠是目前研究ALS較為流行的動物模型之一。其運動癥狀開始于后肢，以雙后肢肌力減退和癱瘓為主，并逐漸發展累及軀干和前肢。B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J轉基因小鼠的主要病理學特征是腰段脊髓前角運動神經元數目丟失，小鼠肌肉萎縮無力，出現明顯的運動行為學障礙，ALS小鼠出現運動功能障礙時運動神經元的數目丟失可達44%以上。因此脊髓前腳運動神經元數目和運動功能是ALS轉基因小鼠疾病進展最可靠和最客觀的評價指標〔14〕。本研究結果表明Res在一定程度上延緩了運動神經元的丟失，改善了ALS小鼠的運動障礙，對SOD1 G93A轉基因小鼠脊髓前角運動神經元具有顯著的保護作用。氧化應激產生的活性氧可直接或間接地損傷細胞內蛋白質、脂質、核酸等大分子物質的生理功能，是包括ALS疾病在內發生的病理生理基礎。8-OHdG是活性氧自由基如羥自由基、單線態氧等攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產生的一種氧化性加和物，是DNA氧化損傷最常用的生物標志物之一〔15〕；3-NT是蛋白質氧化損傷的標記物〔16〕；MDA是生物膜中的多不飽和脂肪酸脂質過氧化作用產物。本研究結果說明，Res抵抗氧化損傷保護脊髓運動神經元。機體細胞本身具有一套復雜的抗氧化系統，該系統組成Nrf2-抗氧化反應元件(ARE)-抗氧化酶通路，Nrf2是細胞氧化應激的重要因子，其通過與ARE相互作用調節編碼抗氧化蛋白，是機體內源性抗氧化應激的重要通路〔17〕。本研究結果說明，Res可通過激活Nrf2-HO 1抗氧化應激通路抵抗自由基對組織的氧化損傷，從而降低8-OHdG、3-NT和MDA的含量。Res在阿爾茨海默病、帕金森病等多種神經退行性疾病中具有神經保護作用，其保護作用是通過抑制自由基產生、神經細胞凋亡及改善線粒體功能等實現。Res極有可能成為新的以神經元保護為特點的抗 ALS藥物，因此其在臨床治療ALS及其他神經變性疾病中的意義有必要深入研究。