大紅火龍果花粉離體萌發條件的優化及其活力測定方法篩選

孫佩光，程志號，李洪立，孫長君，郭素霞，丁哲利，吳 瓊*

(1.中國熱帶農業科學院 海口實驗站/海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，海南 海口 571010； 2.中國熱帶農業科學院 熱帶作物品種資源研究所，海南 海口 570100)

火龍果〔Hylocereusundatus(Haw.)Britt. et Rose〕又名紅龍果、仙蜜果、龍珠果，屬仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereusundatus)[1]。火龍果作為一種新興熱帶水果在我國的栽培歷史較短，生產上的栽培品種主要來自中國臺灣和越南，存在品種老化、自交不親和、需要人工授粉等問題[2-4]。此外，火龍果在自然授粉條件下存在落花落果嚴重、單果重小、經濟價值不高等問題。戴雪香[5]報道，火龍果單株開花量平均為15朵，在自然授粉時約有47.71%花蕾在花后脫落。異花授粉能夠顯著降低落花率、提高座果率和單果重、促進果實發育，并且還可以改善果肉顏色、果實品質和風味等[6-8]，而決定異花授粉成功的關鍵是花粉萌發率(生產中采用培養基測定的為花粉萌發率)/花粉活力(生產中采用染色法進行測定的為花粉活力)。

花粉萌發率/花粉活力低，花粉管生長緩慢將無法完成受精或授粉受精不良；花粉萌發率/花粉活力高，花粉管能夠快速伸長到達子房完成授粉受精過程[9]。而花粉萌發率/花粉活力高低除與自身質量相關外，還與萌發時蔗糖、硼酸、pH、生長調節劑等環境條件密切相關[10-12]。因此，人為輔助改善火龍果花粉萌發條件以期提高其授粉受精能力至關重要。目前關于花粉萌發條件優化的報道多集中于梨[10]、桃[9]等大眾果樹，火龍果的相關研究較少。

花粉萌發率/花粉活力直接決定了火龍果坐果率和產量，準確測定花粉萌發率/花粉活力對于豐產栽培、雜交育種以及果實品質改良等具有重要意義。花粉萌發率的測定采用離體萌發法進行，該方法準確率高，但是耗時較長。染色法測定的花粉活力耗時短，但存在已染色但不萌發的現象。對于火龍果花粉活力的研究已有少量報道，但由于測定方法、品種差異、栽培措施和萌發條件等差異，所得的研究結果不同。胡子有等[13]用形態觀察法檢測紅皮紅肉和紅皮白肉火龍果的花粉活力均在90%以上；林平等[14]采用碘-碘化鉀(I2-KI)染色法和氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定紅皮紅肉火龍果的花粉活力為40%～70%；謝穗紅等[15]利用離體萌發法測定(培養基含25%蔗糖+ 0.05%硼酸)白玉龍、珠龍火龍果和霸王花的花粉萌發率分別為61.38%、58.95%和 52.81%；王玉林等[12]使用液體培養基測定紅皮紅肉火龍果的花粉活力最高，為65.76%。

目前，鮮見采用離體萌發法、醋酸洋紅染色法、I2-KI染色法、TTC染色法和亞歷山大紅染色法等多種方法對比分析火龍果花粉萌發率/花粉活力的系統報道。對影響花粉萌發條件的蔗糖濃度、硼酸濃度和培養基pH等條件進行優化，探索適宜大紅火龍果花粉萌發的適宜條件和培養基組分，并在此基礎上運用不同方法測定大紅火龍果的花粉活力，篩選準確、快速測定火龍果花粉活力的最佳方法，以期為大紅火龍果人工授粉及其豐產栽培、雜交育種以及果實品質改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大紅火龍果(Hylocereusmonacanthus)花粉采自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所實驗基地。2019年9-0月于花朵開放前，選擇無病蟲害、生長一致的5～6朵花帶回實驗室水培，待到20:30-21:30花朵全部綻放時，使用毛筆輕輕掃落花粉粒于硫酸紙上，收集5～6朵花的花粉并等量混勻，用毛筆蘸取少許花粉，播撒在不同的蔗糖濃度梯度、硼酸濃度梯度和pH梯度的培養基上，28℃恒溫光照培養箱中培養12 h以上。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗設計 依次對蔗糖濃度、硼酸濃度和pH 3個因素進行篩選和優化。花粉萌發的基礎培養基 (BK1) 組成為硼酸(H3BO4)100 mg/L + Ca(NO3)2·4H2O 0.3 g/L + MgSO4·7H2O 1.2 g/L + KNO30.1g/L + 1%瓊脂，pH6.5，以此培養基為基礎，分別進行蔗糖濃度和硼酸濃度的篩選。蔗糖梯度設置5%、10%、15%、20%、25%、30%等6個梯度，硼酸濃度設置100 mg/L、300 mg/L、500 mg/L、700 mg/L、1 100 mg/L和1 300 mg/L 6個硼酸梯度；根據上述試驗篩選出花粉萌發率高且有利于花粉管生長伸長的最適蔗糖濃度、硼酸濃度，并將最適宜的蔗糖濃度和硼酸濃度帶入基礎培養基 BK1中配置成培養基BK2，使用手持式pH計測定未調pH時的BK2培養基pH為6.7，因此pH設6.0、6.7、7.0和8.0 4個梯度。每個處理3個培養皿，每個培養皿至少觀察3個視野。萌發花粉以花粉管超過花粉粒直徑為萌發，花粉萌發率用以下公式計算：

1.2.2 不同染色法測定火龍果花粉生活力的比較 TTC染色法測定花粉活力參照文獻[16]進行；I2-KI測定花粉活力參照文獻[17]進行；醋酸洋紅測定花粉活力參照文獻[18]進行；亞歷山大紅測定花粉活力方法參照文獻[19]進行。將不同測定方法的火龍果花粉活力計數，每處理觀察3個載玻片，3次重復。

1.3 數據統計和分析

使用Excel 2007和SPSS 19.0對數據進行統計與分析。

2 結果與分析

2.1 不同因素對大紅火龍果花粉萌發率的影響

2.1.1 蔗糖濃度 從封3圖版Ⅰa～f可知不同蔗糖濃度處理的大紅火龍果花粉萌發情況。從圖1可知，低濃度的蔗糖對花粉萌發率的促進作用不明顯。 5%濃度梯度下花粉萌發率較低，為(18.62 ± 2.31)%(封3圖版Ⅰ a)。隨著蔗糖濃度梯度增加，大紅火龍果花粉萌發率呈現先增后減的單峰型變化；蔗糖濃度為15%時，花粉活萌發率最高，為(54.68±4.46)%，該條件下的花粉管生長較長(封3圖版Ⅰ c)；高濃度蔗糖(25%)培養基上花粉管生長和伸長受到抑制，尤其是30%蔗糖濃度時表現尤為明顯(封3圖版Ⅰ e，f)。蔗糖濃度為15%和20%時花粉萌發率無顯著差異，但二者與其他濃度蔗糖處理的花粉萌發率差異極顯著，從提高花粉萌發率的角度宜選15%蔗糖濃度。

注：圖中不同大小寫字母表示差異極顯著(P< 0.01)和顯著(P< 0.05)，下同。

Note: Differentcapital and lowercase letters mean significantly different atP<0.01 andP<0.05 levels, respectively. The same below.

圖1 不同蔗糖濃度處理大紅火龍果的花粉萌發率

Fig.1 Pollen germination rate ofH.monacanthustreated with different sucrose concentrations

2.1.2 硼酸濃度 從圖2和封3圖版Ⅰg～m可知，在硼酸濃度為100 mg/L時，大紅花粉萌發率較低；隨著硼酸濃度梯度增加，花粉萌發率在一定程度上呈增加趨勢；在硼酸濃度為700 mg/L時花粉萌發率最高，為(43.90±6.27)%。硼酸濃度為500 mg/L和700 mg/L的花粉萌發率差異顯著；硼酸濃度為700 mg/L時的花粉萌發率與900 mg/L、1 100 mg/L和1 300 mg/L的花粉萌發率無顯著差異。然而高濃度的硼酸容易造成大紅火龍果花粉內含物外溢，且花粉管生長受抑制，較高濃度的硼酸容易引起花粉管變粗，并嚴重抑制花粉管伸長(封3圖版Ⅰ k～m)。因此，大紅火龍果離體萌發較適宜的硼酸濃度為700 mg/L。

Fig.2 Pollen germination rate ofH.monacanthustreated with different boric acid concentrations

2.1.3 培養基pH 從圖3可知，培養基溶液pH為7.0時，花粉萌發率最高，為(45.77±4.82)%；而pH6.7時花粉萌發率次之，為(43.9±6.27)%；pH7.0與pH6.7的花粉萌發率無顯著差異；當培養基溶液pH6.0或pH8.0時，花粉的萌發率均低于40%。pH6.7、pH7.0的花粉萌發率與pH6.0、pH8.0的花粉萌發率差異極顯著。pH6.7的培養基上花粉萌發時很少發生內含物外溢現象，花粉管伸長也未受明顯抑制；而pH7.0的培養基上花粉萌發時存在許多內含物溢出現象，其花粉管前部呈現螺旋狀或卷曲狀不生長等現象，且花粉管長度明顯較短(封3圖版Ⅰ o～q)。因此，從促進花粉萌發和花粉管伸長的角度，離體萌發法培養基的pH宜選擇pH6.7。

Fig.3 Pollen germination rate ofH.monacanthuson medium with different pH

2.2 不同方法測定大紅火龍果的花粉活力

從封3圖Ⅱa～e可知不同方法測定大紅火龍果的花粉染色情況/萌發情況。從圖4可知，不同方法測定大紅火龍果的花粉萌發率依次為離體萌發法>醋酸洋紅染色法>TTC染色法>I2-KI染色法>亞歷山大紅染色法。離體萌發法與醋酸洋紅染色法測定的花粉活力無顯著差異，離體萌發法與I2-KI染色法、TTC染色法和亞歷山大紅染色法測定的花粉活力差異達極顯著水平。因此，在同時考察火龍果花粉萌發率和花粉管生長速度時應首選離體萌發法，而準確測定其花粉活力的方法，優選醋酸洋紅染色法。

注：YS為亞歷山大紅染色法，CS為醋酸洋紅染色法，DK為I2-KI染色法，TT為TTC染色法，IV為離體萌發法。

Note: YS is Alexander red staining; CS is Carmine acetate staining; DK is I2-KI staining; TT is TTC staining; IV is in vitro germination.

圖4 不同方法測定大紅火龍果的花粉活力

Fig.4 Pollen viabilities ofH.monacanthusdetected by different methods

3 結論與討論

蔗糖是花粉管細胞分裂和生化過程中主要碳源及營養物質來源；硼元素則參與了花粉管壁的形成、花粉管的囊泡運輸、碳水化合物吸收以及酚類物質的代謝等一系列生理生化過程[20]。已有研究表明，含有10%蔗糖和0.01%硼酸的固體培養基有利于桃、杏花粉的萌發和花粉管的生長[9,21-22]；而梨、篤斯越桔等果樹花粉萌發需要10%～15%的蔗糖和300 mg/L的硼酸[10,23]。高賽等[24]報道，‘秦冠’蘋果花粉在含有20%蔗糖和0.01%硼酸的培養基上萌發率最高；甜櫻桃花粉萌發較適宜的培養基含有20%的蔗糖和0.1%硼酸[25]。謝穗紅等[15]報道，一些品種的火龍果和霸王花花粉在25%的蔗糖+ 500 mg/L硼酸培養基上萌發率最高；王玉林等[12]報道火龍果花粉在含有35%蔗糖 + 600 mg/L硼酸 + pH 6.7的液體培養基上萌發最好，而在含有30%蔗糖 +400 mg/L硼酸 + pH 7.5的培養基上花粉管生長最長。研究表明，大紅火龍果花粉在含有15%蔗糖和700 mg/L硼酸培養基上萌發率最高，且花粉管生長較好。大紅火龍果花粉萌發時對蔗糖的需求與大多數果樹相似，但對硼酸的需求遠高于其他果樹品種。研究結果與桃[9]、‘嘎啦’蘋果[26]、梨[27]等果樹上研究證實高濃度的蔗糖抑制花粉萌發結論一致。可能是高濃度的蔗糖容易引起花粉原生質體質壁分離[28]，導致花粉快速失去活性而不能正常萌發。

梨[10]、蘋果[26]、篤斯越桔[23]、甜櫻桃[25]等果樹花粉萌發較適宜的培養基pH為6.5～6.8。王玉林等[12]報道培養基pH6.5時火龍果萌發效果較好，而培養基pH7.5時對花粉管伸長具有促進作用。研究表明，在pH6.7的培養基上，最適宜大紅火龍果萌發和花粉管伸長。研究結果與王玉林等[12,15]研究結果不太一致，可能與品種差異、培養基組成成分不同和花粉萌發條件不同等因素有關。

大紅火龍果花粉離體萌發較適宜的培養基組成為Ca(NO3)2·4H2O 0.3 g/L + MgSO4·7H2O 1.2 g/L + KNO30.1 g/L+ 15%蔗糖+ 700 mg/L硼酸 + 1%瓊脂，pH6.7。在此基礎上，可通過調整蔗糖濃度、硼酸濃度和pH，得到其他品種的火龍果花粉萌發的較適宜條件。離體萌發法與醋酸洋紅染色法測定的花粉活力無顯著差異，而與I2-KI染色法、TTC染色法和亞歷山大紅染色法測定的花粉活力差異極顯著。在考察大紅火龍果花粉萌發率和花粉管生長情況時應首選離體萌發法，準確測定其花粉活力時優選醋酸洋紅染色法。