胃癌患者血漿微小RNA-100表達水平及其臨床意義*

張 銘，張新望，艾 靜，張衛(wèi)濤，魏益群，李 靜

1.西安交通大學附屬紅會醫(yī)院(西安 710054); 2.陜西省人民醫(yī)院呼吸與危重癥一科(西安 710068)；3.陜西省人民醫(yī)院中醫(yī)科(西安 710068)

胃癌是消化道腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，我國胃癌發(fā)病人數(shù)占世界胃癌新發(fā)病例數(shù)量的40%以上，發(fā)病率在我國各類惡性腫瘤中排名第二，死亡人數(shù)每年約有35萬，占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的25%[1-2]。胃癌最大的特點是早期無明顯癥狀或僅有上腹部不適、噯氣等非特異癥狀，容易被忽視，大部分患者就診時已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移因此早期診斷至關(guān)重要[3-4]。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR) 是一種非編碼單鏈RNA分子，長度約為18～25 個核苷酸，不編碼蛋白質(zhì)，但可以發(fā)揮基因調(diào)控作用，研究發(fā)現(xiàn)其通過與靶基因 mRNA 的 3’端非編碼區(qū)域結(jié)合進而抑制或降解靶基因mRNA的翻譯而起效。大量研究證明miRNA 參與了細胞增殖、凋亡、分化等過程，在腫瘤發(fā)病機制中起著重要作用[5-9]，目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)多種miRNAs 在胃癌中表達異常。miR-100是屬于miR-99家族成員之一，長度為22個核苷酸，大量研究發(fā)現(xiàn)miR-10在多種實體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤中表達異常，在腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌作用，可以作為腫瘤診斷和預后的指標之一。國外研究發(fā)現(xiàn)miR-100在胃癌患者組織中的表達水平降低，有可能發(fā)揮抑癌作用，但機制尚不清楚[10-11]。隨著檢驗技術(shù)的不斷提高，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)循環(huán)中的miRNAs與腫瘤組織細胞內(nèi)的miRNAs水平變化一致。循環(huán)中的miRNAs大多以核酸-蛋白復合物形式存在，能抵抗RNA酶的降解，具有高度穩(wěn)定性。因此，循環(huán)中的miRNAs被認為是比較理想的標志物。為了探討 miR-100在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究利用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測正常對照及胃癌患者血漿中miR-100的水平，并進一步分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

資料與方法

1 一般資料 入選 2018年1月至2019年1月期間在西安交通大學醫(yī)學部附屬紅會醫(yī)院消化內(nèi)科確診的40例胃癌患者，其中男24例 ，女16例，年齡45～76歲，平均(62.80±16.13)歲 ，均為胃鏡檢查病理確診病例。所有胃癌患者依據(jù)AJCC/UICC 胃癌 TNM 分期系統(tǒng)進行分期。選同期健康體檢者40 例作為正常對照，其中男25例，女15例，年齡32～73歲，平均(53.16±14.72)歲。本研究得到西安交通大學醫(yī)學部附屬紅會醫(yī)院倫理委員會的批準及患者知情同意。

2 研究方法

2.1 血漿樣本采集： 胃癌患者在手術(shù)或進行化療、放療等治療前采集血樣，清晨空腹狀態(tài)下，采集胃癌患者和健康體檢者外周靜脈血5.0 ml，放入EDTA 抗凝管中待用。常溫3000 r/min 離心10 min，取上清血漿放入無RNA酶的管中，4 ℃ 12000 r/min再次離心10 min，吸取上清至新的EP管中，分裝后-80 ℃保存。

2.2 主要試劑與儀器： mirVanaTM miRNA RNA 提取試劑購自美國Ambion 公司，miScript Reverse Transcription試劑購自美國Ambion公司，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ購自德國Qiagen公司，Nondrop 2000 微量分光光度計為美國賽默飛公司產(chǎn)品，5804R型冷凍高速離心機為德國 Eppendorf 公司產(chǎn)品，實時熒光定量 PCR 儀為美國伯樂公司產(chǎn)品。

2.3 莖環(huán)RT-PCR檢測血漿中miR-100的水平：采用mirVanaTM miRNA分離試劑盒提取血漿總RNA，操作嚴格按照說明書進行。利用微量分光光度計測量待定RNA樣品的濃度及及純度。根據(jù)文獻[12]由上海生工公司分別合成miR-100 和內(nèi)參照U6 的引物，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應條件為：37 ℃ 60 min ，95 ℃ 5 min ，cDNA于-20 ℃保存。采用莖環(huán)RT-PCR技術(shù)對miR-100進行擴增，PCR擴增條件為：95 ℃預變性 3 min，95 ℃ 5 s、61 ℃ 30 s 35個循環(huán)。

結(jié) 果

1 兩組血漿中miR-100 水平的比較 采用莖環(huán)RT-PCR 方法檢測胃癌組和正常對照組患者血漿中miR-100的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對照組血漿中miR-100的水平為(0.58±0.18)，胃癌患者血漿中 miR-100 的水平為(0.35±0.21)，兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義(t= 6.375，P<0.01)。

2 miR-100 水平與胃癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 在不同年齡 、性別及腫瘤直徑之間血漿miR -100水平的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與無淋巴轉(zhuǎn)移的胃癌患者相比，有淋巴轉(zhuǎn)移的患者血漿中miR-100的水平明顯降低(P<0.05 )；與無遠處轉(zhuǎn)移的胃癌患者相比，有遠處轉(zhuǎn)移的患者血漿中miR-100的水平明顯降低(P<0.05 )。與Ⅰ/Ⅱ期胃癌患者相比，Ⅲ/Ⅳ期胃癌患者血漿中 miR-100的水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05 )，見表 1。

討 論

胃癌是一種危害極大的常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，根據(jù)我國2015年癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示胃癌男性病死率排名第二，女性病死率排名第四。我國每年有46萬新發(fā)胃癌患者，每年有35萬人死于胃癌[2]。由于胃癌早期癥狀不明顯，有超過90%的患者是疾病發(fā)展到中晚期才到醫(yī)院就醫(yī)診斷的，他們中的80%達不到5年生存率。因此，對于胃癌的防治關(guān)鍵是早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療，其中早期診斷就顯得至關(guān)重要。早在1993年，國外研究人員意外的在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種RNA分子，它的長度為22個核苷酸。令人驚奇的是，盡管它們不能編碼蛋白，但是它們卻可以控制線蟲細胞發(fā)育，由此引發(fā)了miRNA的研究序幕[5]。miRNA的表達具有高度保守性、組織特異性及時序特異性。研究證實miRNA不但參與個體發(fā)育，而且還在細胞增殖、凋亡、分化等過程中起重要作用。

表1 miR-100水平與胃癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中多種miRNAs表達水平異常，miRNAs在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲以及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[10-11]。雖然機制尚不是十分清楚，但根據(jù)其在胃癌中的作用分為促癌和抑癌miRNA兩大類，前者一般在胃癌組織中表達升高，主要功能是抑制細胞凋亡，進而促進胃癌細胞增殖、侵襲以及遠處轉(zhuǎn)移；后者一般在胃癌組織中表達降低，主要功能是促進細胞凋亡，進而抑制胃癌細胞增殖、侵襲以及遠處轉(zhuǎn)移。miR-100是2002年由Mourelatos等發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，屬于miR-99家族成員之一。國內(nèi)外多項研究發(fā)現(xiàn)miR-100可能是肺癌、肝癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、腎細胞癌、宮頸癌、膀胱癌等腫瘤預后的一個指標[13-18]。目前關(guān)于miR-100與胃癌發(fā)病機制的研究文獻多集中于報道其在胃癌組織內(nèi)的表達水平，研究發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，miR-100在胃癌組織中的表達水平明顯降低，進一步分析發(fā)現(xiàn)miR-100的水平與腫瘤組織的大小、是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，推測miR-100在胃癌發(fā)病中可能發(fā)揮了抑癌機制。國內(nèi)學者近幾年對于miR-100和胃癌的發(fā)病機制研究也取得了一些進展，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miR-100的表達水平低于胃癌癌旁組織，并且與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)[19-20]。

循環(huán)中的miRNAs大多以核酸-蛋白復合物形式存在，能抵抗RNA酶的降解，具有高度穩(wěn)定性，外周血取材容易，因此外周血miR-100的檢測可能成為一個新的胃癌診斷血清學指標。本研究通過莖環(huán)RT-PCR方法檢測血漿中miR-100表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿中miR-100的水平在胃癌患者中比對照組顯著降低(P<0.01)，血漿中miRNA-100的水平與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小均無顯著相關(guān)(P>0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移以及腫瘤TNM分期等臨床病理特征有關(guān)(P<0.05)，但檢測結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)miR-100的表達水平與腫瘤組織的直徑有關(guān)，這可能與病例選擇、直徑測量誤差等因素等有關(guān)。

綜合我們以及國內(nèi)外研究結(jié)果提示:miR-100可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，有可能成為胃癌早期診斷及治療、評估胃癌預后新的指標。但由于樣本的限制，應進一步擴大樣本量，增加檢測時間段，動態(tài)監(jiān)測胃癌患者血漿中miR-100的水平，觀察其在胃癌術(shù)前、術(shù)后不同時間段的表達變化，對所有患者進行術(shù)后跟蹤隨訪，根據(jù)預后資料進一步驗證分析miR-100在胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能和作用機制。