基于孢子壁蛋白基因靶點(diǎn)的蝦肝腸胞蟲實(shí)時(shí)熒光定量PCR 體系的構(gòu)建及應(yīng)用

汪 浩，汪 瑋，施 慧，何 杰，謝建軍，王庚申，許文軍

(浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021)

蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)最早于2009 年由泰國學(xué)者TOURTIPA,et al[1]在生長(zhǎng)緩慢的斑節(jié)對(duì)蝦Penaeus monodon 中發(fā)現(xiàn)并命名，隨后，在泰國本土養(yǎng)殖的患有“白便綜合癥”(white feces syndrome)的凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei 中也檢出大量的EHP 攜帶，然而，進(jìn)一步研究并未發(fā)現(xiàn)EHP與對(duì)蝦“白便”癥之間具有相關(guān)性[2]。此后幾年內(nèi)，在整個(gè)東南亞地區(qū)包括印度、中國、越南、馬來西亞、印度尼西亞等地相繼有EHP 感染凡納濱對(duì)蝦的報(bào)道[3-5]。自2013 年起，我國的浙江、天津、山東等地區(qū)發(fā)現(xiàn)了凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)遲緩、個(gè)體大小不均一的問題，隨后在發(fā)病對(duì)蝦中檢出并確認(rèn)其是由于EHP 所引起[5-6]，而后在我國遼寧、粵西地區(qū)也相繼有EHP 檢出的報(bào)道，EHP 的檢出率和范圍呈逐年擴(kuò)大的趨勢(shì)[7]。雖然現(xiàn)有的研究并未明確EHP 感染與對(duì)蝦患病之間的關(guān)系，然而，區(qū)域數(shù)據(jù)顯示，在出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢以及“白便”癥狀的蝦塘中，蝦體通常具有較高的EHP 攜帶率，提示二者間具有一定的關(guān)聯(lián)性[8-9]。

鑒于EHP 感染可能引起對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢等嚴(yán)重危害對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)的不良癥狀，為了更好地監(jiān)控EHP 的感染和傳播，急需一種準(zhǔn)確有效的EHP 檢測(cè)方法。由于EHP 感染沒有清晰易察的診斷癥狀，EHP 蟲體通常寄生于對(duì)蝦肝胰腺或中腸表皮細(xì)胞內(nèi)，成熟的EHP 孢子大小僅為0.7 μm×1.1 μm，光學(xué)顯微鏡難以發(fā)現(xiàn)，給診斷帶來了難度[1,8]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者開發(fā)了一批基于SSU rRNA 靶點(diǎn)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，包括常規(guī)及套式PCR、地高辛標(biāo)記核酸探針原位雜交、LAMP、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 等[10-14]。然而，正如TOURTIPA,et al[1]所報(bào)道，EHP 的SSU rRNA 與比氏腸胞蟲E.bieneusi 具有高達(dá)84%的同源性，且養(yǎng)殖對(duì)蝦中也常有其他種類微孢子蟲感染的報(bào)道[15]，因而，基于SSU rRNA 設(shè)計(jì)的各類擴(kuò)增引物及探針均存在錯(cuò)配和非特異擴(kuò)增的可能。JAROENLAK,et al[16]分析了TANGPRASITTIPAP A,et al[2]在研究中涉及的EHP 套式檢測(cè)引物，并將其與4 種可能對(duì)EHP 檢測(cè)產(chǎn)生干擾的微孢子蟲的SSU rRNA 序列進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其同源性分別高達(dá)86.4%，66.7%，90%和74%，進(jìn)一步的PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，基于EHP SSU rRNA 設(shè)計(jì)的套式引物能夠有效擴(kuò)增其中2 種源于蟹的微孢子蟲，且擴(kuò)增產(chǎn)物大小也與陽性對(duì)照完全一致，據(jù)此，JAROENLAK,et al[16]提出了一種新的基于EHP 孢子壁蛋白(spore wall protein，SWP)基因?yàn)榘悬c(diǎn)的套式PCR 檢測(cè)方法，相比于SSU rRNA 靶點(diǎn)，SWP 靶點(diǎn)具有更高的特異性。

本研究基于JAROENLAK,et al[16]上傳的EHP 孢子壁蛋白基因序列(GenBank：KX258197.1)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了基于孢子壁蛋白基因?yàn)榘悬c(diǎn)的EHP 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)體系，并利用新構(gòu)建的檢測(cè)體系對(duì)一例出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩、個(gè)體大小不一癥狀的養(yǎng)殖試驗(yàn)塘中的凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行了EHP 定量分析，為EHP 的生產(chǎn)檢測(cè)和流行病學(xué)分析提供了新的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 病樣來源

出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩、個(gè)體大小不一的凡納濱對(duì)蝦樣本采集自本課題組負(fù)責(zé)的對(duì)蝦養(yǎng)殖試驗(yàn)塘，位于浙江海洋大學(xué)西閃島試驗(yàn)基地，所采集的蝦樣本均測(cè)量其體長(zhǎng)(精確到0.1 cm)，解剖取出肝胰腺，凍存于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱保存。用于引物特異性檢測(cè)的凡納濱對(duì)蝦病毒及病菌的DNA 模板為本實(shí)驗(yàn)室歷年采集自舟山本地及象山、臨海等地的蝦病樣中提取并保存。

1.1.2 試劑與儀器

本試驗(yàn)使用的DNA 提取試劑盒購自Qiagen 公司，pEASY-T1 系列載體購自北京全式金公司，高保真Taq 酶、SYBR 熒光定量試劑購自Takara 公司，其他試劑均采用國產(chǎn)分析純。

試驗(yàn)涉及的主要儀器：NanoDrop 2000c 核酸濃度測(cè)定儀(Thermo，美國)、StepOnePlus Real-Time PCR System(Thermo，美國)，Applied biosystems 2720 Thermal Cycler 型PCR 儀(Thermo，美國)，Bio Rad Gel Doc XR170-8170 凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad，美國)。

1.2 蝦樣肝胰腺總DNA 的提取

將超低溫保存的蝦肝胰腺取出置于4 ℃冰箱化凍后，剪取部分肝胰腺(10～20 mg)稱量后用于總DNA抽提，記錄每份肝胰腺樣本的重量，整個(gè)過程為無菌操作。用于DNA 抽提的肝胰腺組織經(jīng)剪碎并研磨后，采用DNA 提取試劑盒、按照說明書提供的流程提取總DNA，提取的DNA 經(jīng)核酸濃度測(cè)定儀測(cè)量濃度后，凍存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)及常規(guī)PCR

根據(jù)Genbank 收錄的蝦肝腸胞蟲孢子壁蛋白基因(序列號(hào)KX258197.1)，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物SWP-RTF(5′-TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGT-3′) 和SWP-RTR (5′-GCTGTTTGTCTCCAACTGTAT-3′)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段堿基數(shù)為184 bp。以攜帶EHP 的蝦肝胰腺DNA 為模板，SWP-RTF/R為引物，采用50 μL 擴(kuò)增體系：5 μL 10 × PCR 緩沖液，4 μL dNTP (2.5 mmol·L-1)，1 μL 模板DNA,0.5 μL SWP-RTF/R 引物(20 μmol·L-1)，0.5 μL 高保真ExTaq 酶,38.5 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃30 s、55 ℃40 s、72 ℃20 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃，8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品模板的制備

上述常規(guī)PCR 獲得SWP 的擴(kuò)增產(chǎn)物后，用核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定其濃度，使用pEASY-T1 Simple Cloning kit 試劑盒按照說明書推薦的反應(yīng)體系進(jìn)行TA 克隆，并通過熱激轉(zhuǎn)化Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞。完成轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后，涂布于含有卡那霉素的LB 平板上，過夜培養(yǎng)。挑選平板單菌落，用M13F/M13R 引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)，選取檢測(cè)結(jié)果陽性的1～2 個(gè)單克隆，用OMEGA 質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒，送上海華大基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與KX258197.1 序列比對(duì)100%吻合的質(zhì)粒命名為SWP-T，經(jīng)核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定其濃度為211 ng·μL-1，換算成拷貝數(shù)為5.02×1010copies·μL-1，以此質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品原液，凍存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系參照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH plus)試劑盒說明書推薦的20 μL反應(yīng)體系，并對(duì)不同的引物濃度及退火溫度的擴(kuò)增效果進(jìn)行對(duì)比。設(shè)置0.2、0.4、0.6 μmol·L-13 種引物終濃度，退火溫度設(shè)置為55～60 ℃。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃5 s，55～60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后測(cè)定熔解曲線。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

將制備好的標(biāo)準(zhǔn)品原液用ddH2O 進(jìn)行10 倍梯度稀釋，獲得終濃度為5.02×101～5.02×108copies·μL-1的8 個(gè)濃度梯度，每個(gè)梯度設(shè)置3 個(gè)平行，按照上述優(yōu)化的體系進(jìn)行qPCR，得出拷貝數(shù)與Ct 值的線性關(guān)系，根據(jù)擴(kuò)增效率和相關(guān)性系數(shù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量進(jìn)行分析。

1.7 qPCR 靈敏度測(cè)試

將標(biāo)準(zhǔn)品原液用ddH2O 梯度稀釋成5.02×100～5.02×108copies·μL-1共9 個(gè)梯度，作為測(cè)試模板，以SWP-RTF/R 作為引物，按照上述建立的qPCR 反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。常規(guī)PCR 采用模板濃度為5.02×101～5.02×106copies·μL-1共6 個(gè)梯度，按照先前設(shè)定的體系進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后，對(duì)2 種方法的靈敏度進(jìn)行對(duì)比分析。

1.8 qPCR 引物的特異性檢測(cè)

選取本實(shí)驗(yàn)室前期采集保存的、分別感染了傳染性皮下造血器官壞死病毒(IHHNV)、白斑綜合征病毒(WSSV)、蝦虹彩病毒(SHIV)、副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus 或哈維氏弧菌V.harveyi 的蝦總DNA，以攜帶EHP 的蝦總DNA 作為陽性對(duì)照，健康蝦總DNA 作為陰性對(duì)照，去離子水作為空白對(duì)照，按照上述優(yōu)化的qPCR 反應(yīng)體系，檢測(cè)引物SWP-RTF/R 的特異性。

1.9 應(yīng)用qPCR 分析EHP 攜帶量與蝦個(gè)體大小間的關(guān)系

從出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、個(gè)體大小差異明顯癥狀的凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖試驗(yàn)塘中隨機(jī)采集51 尾蝦，按個(gè)體大小(體長(zhǎng)差異)分為3 組，每組17 尾：a 組體長(zhǎng)7～9 cm；b 組體長(zhǎng)10～12 cm；c 組體長(zhǎng)13～15 cm。按上述構(gòu)建的qPCR 體系對(duì)3 組蝦樣分別作單尾蝦EHP 攜帶量檢測(cè)，以每克蝦肝胰腺組織中攜帶的EHP 拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值定義為感染指數(shù)(relative exponential copies of EHP infection)，繪制蝦的體長(zhǎng)與感染指數(shù)的XY 散點(diǎn)圖，對(duì)3 組處于不同大小區(qū)間的蝦樣分別計(jì)算其感染指數(shù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差，并分析體長(zhǎng)與感染指數(shù)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 qPCR 反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

采用5×104copies·μL-1濃度的SWP-T 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，確立了基于EHP-SWP 為靶點(diǎn)的qPCR 的最佳反應(yīng)體系，其中引物濃度為0.2 μmol·L-1時(shí)擴(kuò)增效率最高，退火溫度為60 ℃時(shí)引物特異性及擴(kuò)增效率最佳。即最佳反應(yīng)體系為：2×SYBR Premix Ex Taq 試劑10 μL，20 μmol·L-1的SWP-RTF/R 引物各0.4 μL，ROX Reference Dye 校正液0.4 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 6.8 μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用優(yōu)化好的條件對(duì)10 倍梯度稀釋(5.02×101～5.02×108copies·μL-1)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，繪制Ct 值與標(biāo)準(zhǔn)模板拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值[log(SQ)]之間線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板在5.02×101～5.02×108copies·μL-1范圍內(nèi)，qPCR 均有明顯熒光信號(hào)出現(xiàn)，Ct 值在8～32 之間；構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)換算公式為：Ct=-0.284 4 log(SQ)+10.45，R2=0.992。擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線(圖2)起峰單一，起峰位置高度重疊，熔解溫度(Tm 值)為79.76 ℃，表明該方法擴(kuò)增過程中沒有非特異擴(kuò)增和引物二聚體的產(chǎn)生。

圖1 蝦肝腸胞蟲SWP 標(biāo)準(zhǔn)品qPCR 擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of qPCR for SWP of EHP with standard plasmid as the template

圖2 蝦肝腸孢蟲SWP 標(biāo)準(zhǔn)品qPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線Fig.2 Melting curves of qPCR for SWP of EHP with standard plasmid as the template

2.3 qPCR 與常規(guī)PCR 靈敏度對(duì)比

qPCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖3)，對(duì)于濃度在5.02×101～5.02×108copies·μL-1區(qū)間內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板，qPCR均有明顯的熒光信號(hào)，Ct 值在8～33 之間，當(dāng)模板濃度稀釋至5.02×100copies·μL-1時(shí)，qPCR 無明顯的熒光信號(hào)，說明qPCR 的最低檢測(cè)限為5.02×101copies·μL-1。與此對(duì)應(yīng)的，濃度為5.02×101～5.02×106copies·μL-1的質(zhì)粒模板的常規(guī)PCR 擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)后的電泳結(jié)果顯示，當(dāng)質(zhì)粒濃度降至5.02×102copies·μL-1時(shí)，電泳條帶微弱至幾不可見(圖4)，當(dāng)質(zhì)粒濃度為5.02×101copies·μL-1時(shí)，電泳條帶消失。通過2 種方法的比較，說明qPCR 較常規(guī)PCR 檢測(cè)的特異性至少高出1～2 個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖3 蝦肝腸胞蟲SWP qPCR 擴(kuò)增的靈敏度測(cè)試Fig.3 Sensitivity test of qPCR for SWP of EHP with plasmid standard template

圖4 蝦肝腸胞蟲SWP 常規(guī)PCR 擴(kuò)增的靈敏度測(cè)試Fig.4 Sensitivity test of conventional PCR for SWP of EHP with plasmid standard template

2.4 qPCR 引物特異性檢測(cè)

經(jīng)BLAST 搜索，通過Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)的基于蝦肝腸胞蟲SWP 基因的引物SWP-RTF/R 在NCBI 數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)與其他病原序列相匹配。針對(duì)分別感染不同蝦病原(EHP、IHHNV、WSSV、SHIV、副溶血弧菌、哈維氏弧菌)的蝦總DNA 模板的qPCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，除攜帶EHP的蝦DNA 模板呈現(xiàn)出特異擴(kuò)增曲線外，其它模板均無熒光信號(hào)(圖5)，說明本方法設(shè)計(jì)的引物SWP-RTF/R 具有良好的特異性。

圖5 蝦肝腸胞蟲SWP qPCR 擴(kuò)增曲線Fig.5 The amplification curve of specific detection for SWP of EHP

2.5 qPCR 重復(fù)性檢測(cè)

對(duì)梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板(5.02×102～5.02×108copies·μL-1)進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3 個(gè)平行重復(fù)，對(duì)取得的Ct 值計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和組內(nèi)的變異系數(shù)。檢測(cè)結(jié)果顯示，組內(nèi)3 個(gè)平行的Ct 值基本一致，變異系數(shù)均小于2%(表1)，滿足qPCR 對(duì)于組內(nèi)重復(fù)性的要求。表明此方法有良好的重復(fù)性，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠。

表1 蝦肝腸胞蟲SWP qPCR 組內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)Tab.1 Intra-group variability qPCR test for SWP of EHP

2.6 應(yīng)用qPCR 分析EHP 攜帶量與蝦個(gè)體大小間的關(guān)系

對(duì)采集自浙江海洋大學(xué)西閃島試驗(yàn)基地蝦塘內(nèi)的3 組體長(zhǎng)具有明顯差異的對(duì)蝦，qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，51 尾蝦樣均有EHP 攜帶(圖6)。其中，體長(zhǎng)區(qū)間位于7～9 cm 的17 尾蝦，平均感染指數(shù)為5.69±0.91，平均體長(zhǎng)8.13±0.52 cm，感染指數(shù)與體長(zhǎng)間具有極顯著的負(fù)相關(guān)(R=-0.650，P＜0.01)；體長(zhǎng)區(qū)間位于10～12 cm 的17 尾蝦，平均感染指數(shù)為4.86±0.39，平均體長(zhǎng)為11.06±0.65 cm，感染指數(shù)與體長(zhǎng)也具有較顯著的負(fù)相關(guān)(R=-0.532，P＜0.05)；體長(zhǎng)區(qū)間位于13～15 cm 的17 尾蝦，平均感染指數(shù)為4.51±0.55，平均體長(zhǎng)為13.53±0.44 cm，感染指數(shù)與體長(zhǎng)的相關(guān)性不顯著，呈較弱的負(fù)相關(guān)(R=-0.147)。對(duì)3 組蝦樣數(shù)據(jù)的統(tǒng)一分析表明，51 尾蝦的感染指數(shù)與體長(zhǎng)之間也呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性(R2=0.452)。

圖6 采集自西閃島試驗(yàn)基地蝦塘的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中EHP 感染指數(shù)與體長(zhǎng)的相關(guān)性Fig.6 The correlation between the relative exponential copies of EHP infection in hepatopancreas and body length

3 討論

蝦肝腸胞蟲自2009 年被泰國學(xué)者發(fā)現(xiàn)以來[1]，影響范圍不斷擴(kuò)大，整個(gè)東南亞地區(qū)主要的對(duì)蝦養(yǎng)殖國均陸續(xù)有EHP 感染的報(bào)道[3-5]。雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)EHP 感染會(huì)引起對(duì)蝦死亡，然而，高濃度的EHP 攜帶可導(dǎo)致對(duì)蝦生長(zhǎng)遲緩的觀點(diǎn)已普遍為學(xué)者所認(rèn)可[4-5]。EHP 可通過水體及食物等方式傳播感染[17-19]，在感染早期沒有明顯的癥狀，也不像其他寄生水生動(dòng)物的微孢子蟲一樣可觀察到孢囊[5]。EHP 孢子寄生于細(xì)胞內(nèi)且個(gè)體極小，光學(xué)顯微鏡難以觀察到，因而，開發(fā)一種準(zhǔn)確、高效的分子生物學(xué)檢測(cè)方法十分必要。

熒光定量PCR 相較于常規(guī)PCR 法有著操作簡(jiǎn)便、快速高效、高敏感性、高重復(fù)性和高特異性、既可定性又可定量等諸多優(yōu)勢(shì)[20]。有關(guān)蝦肝腸胞蟲的熒光定量檢測(cè)方法，國內(nèi)已有學(xué)者報(bào)道[13-14]，然而，現(xiàn)有的檢測(cè)體系都是基于EHP 的SSU rDNA 序列設(shè)計(jì)的引物。有研究表明[16]，EHP 的SSU rDNA 序列與多種感染水生動(dòng)物的微孢子蟲具有很高的同源性(66.7%～90%)，因而，基于SSU rDNA 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的檢測(cè)引物存在錯(cuò)誤匹配和非特異性擴(kuò)增(假陽性)的可能。本研究構(gòu)建的qPCR 檢測(cè)體系是基于EHP 的孢子壁蛋白(spore wall protein，SWP)序列靶點(diǎn)，相較于SSU rDNA 序列靶點(diǎn)具有更高的特異性。應(yīng)用本研究構(gòu)建的檢測(cè)體系對(duì)采集自試驗(yàn)塘的一批出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩癥狀的蝦樣品進(jìn)行EHP 攜帶量檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定的體長(zhǎng)區(qū)間(7～12 cm)范圍內(nèi)，EHP 感染指數(shù)(每克肝胰腺組織中攜帶EHP 拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值)與體長(zhǎng)之間呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)性，這種相關(guān)性在體長(zhǎng)7～9 cm 區(qū)間內(nèi)比體長(zhǎng)10～12 cm 區(qū)間內(nèi)更為顯著(前者P＜0.01；后者P＜0.05)；而當(dāng)體長(zhǎng)上升到13～15 cm 區(qū)間時(shí)，這種相關(guān)性變得不顯著。劉珍等[14]的研究也表明，蝦的體長(zhǎng)與EHP 載量之間的相關(guān)性會(huì)隨著體長(zhǎng)區(qū)間的變化而變化，但在不同批次的樣品中，這種變化似乎沒有一定的規(guī)律(如：某一批次的樣品在體長(zhǎng)＞4.2 cm 時(shí)表現(xiàn)出顯著相關(guān)性；另一批次樣品則在體長(zhǎng)＜4.4 cm 時(shí)具有更顯著的相關(guān)性)。鑒于目前對(duì)EHP 的感染及致病機(jī)制尚不明確，我們推測(cè)上述現(xiàn)象其可能與養(yǎng)殖水體環(huán)境、苗種差異、飼料營養(yǎng)差異等諸多因素有關(guān)。對(duì)于51 尾蝦的全部數(shù)據(jù)的匯總分析顯示，EHP 感染指數(shù)與體長(zhǎng)具有一定的相關(guān)性(R2=0.452)，大體趨勢(shì)是體長(zhǎng)越小的蝦，其EHP 攜帶量相對(duì)越多。我們推測(cè)這可能與EHP 感染的時(shí)間早晚有關(guān)：感染時(shí)期早的蝦，其生長(zhǎng)在早期即受到抑制，同時(shí)，由于EHP 在蝦體內(nèi)停留的時(shí)間長(zhǎng)，增值的拷貝數(shù)也相對(duì)較多；反之亦然。總體來說，本研究為EHP 的定量檢測(cè)提供了一種新的方法，應(yīng)用本方法檢測(cè)EHP 具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作方便快捷等優(yōu)勢(shì)，為EHP 的早期監(jiān)測(cè)和防控提供了新的手段和思路。