頭針對MPTP誘導的PD小鼠行為學及PI3K、p-Akt (Ser473)蛋白表達的影響

李全,尹洪娜,孫忠人,于楠楠*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

帕金森病(PD)為最為常見的神經系統變性疾病之一，具有高發病率、高致殘率的特點，嚴重影響著患者的日常生活能力及生存質量[1-3]。目前，藥物治療PD在一定程度上可以控制患者病情、緩解臨床癥狀和延緩疾病進程，但長期服用極易出現各種毒副作用以及并發癥。因此，從毒副作用更小、療效更為顯著的層面探索PD治療新方法迫在眉睫。本實驗旨在基于PI3K/AKT信號通路，從動物實驗角度研究頭針治療PD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的選擇及分組

10～11周齡雄性C57BL/6小鼠50只,體質量(20±2)g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供(許可證號SCXK(黑)2013004)。置于室溫(20～24 ℃)，自由飲水、取食，適應性喂養1周后開始建模。建模成功后，隨機選擇10只小鼠標記為正常組(control group)，其余30只小鼠建模成功后隨機分為模型組(model group)、針刺組(BMA group)和美多巴組(Madopar group)，每組各10只。

1.2 實驗藥物

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP,美國Sigma公司)；美多芭 (madopar,上海羅氏制藥有限公司，規格為0.25 g/片，生產批號：H10930198)。

1.3 模型制備

MPTP為最常用的PD動物模型誘導建模方法[4]，為提高模型存活率，參考相關文獻[5]，選用慢速模型制模方法，即每日9:00時對模型組、針刺組和美多芭組小鼠行MPTP腹腔注射，濃度為3 mg/mL(含有MPTP 0.3 mg)，日1次，連續7 d。

1.4 干預方法

實驗第8 d開始(即動物模型建立后)，每日上午9:00 AM對各組小鼠進行相應干預。

針刺組小鼠參照《實驗針灸學》[6]提供的方法，定位大鼠腧穴，局部脫毛、龍膽紫定標，使用0.35 mm×40 mm毫針(貴州安迪醫療器械有限公司，批號：20190715)針刺百會、寧神、舞蹈震顫區(雙側)及風池(雙側)，百會、寧神施以重復捻轉手法，捻轉5 min后休息5 min再施以手法，在留針的30 min內反復進行重復捻轉手法共3次，舞蹈震顫區則連接電針(華佗牌SDZ-II型)，電針刺激頻率10 Hz，電壓1V，每次30 min，日1次連續14 d。

美多芭組小鼠給予美多芭懸濁液灌胃，12 mg/mL(含有美多巴1.2 mg)，日1次，連續14 d。

正常組和模型組則不再做任何處理，僅常規飼養。

1.5 處死及取材

在干預的第14 d，完成行為學實驗后，處死所有存活小鼠，快速剝離中腦和紋狀體，稱重，低溫保存及進行標本制備。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 行為學觀察

各組小鼠于實驗建模前5 d每日進行分別進行爬桿及懸掛行為訓練各2次。分別于實驗前1 d(首次注射MPTP前1天)，造模成功后第0 d，干預第7 d和干預第14 d的10:00時進行爬桿和懸掛行為學觀察以檢測其肢體運動的協調情況。

1.6.1.1 爬桿實驗

將一直徑為2.5 cm的泡沫塑料小球固定于一根長60 cm、粗1 cm的木桿頂端，木桿外纏裹2層紗布以防打滑，將小鼠放于球頂，分別記錄小鼠爬完桿長的上半部分、下半部分及全桿所需時間，根據評分表進行打分，3個時間分數總和為被測小鼠爬桿實驗最終得分。評分標準見表1。

表1 爬桿實驗評分標準(分)

1.6.1.2 懸掛實驗

將小鼠雙前肢懸掛于一水平電線上。根據評分表進行打分。評分標準見表2。

表2 懸掛實驗評分標準(分)

1.6.2 Western Blot法檢測PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白表達

中腦和紋狀體組織勻漿，加入裂解液提取總蛋白后，按( BCA 蛋白濃度測定試劑盒) 進行蛋白定量，向每個樣品管中加 5 μL的4×Loading buffer混勻，煮沸5 min，蛋白于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉膜，加入PI3K、p-Akt (Ser473)(1∶1 000)一抗孵育，4 ℃過夜，PVDF膜在室溫下結合兔二抗(1∶3 000)2 h，加入ECL顯色，采用Image J軟件進行灰度值的分析。

1.7 數據統計學處理

2 結果

2.1 行為學實驗結果

2.1.1 爬桿實驗得分比較

與空白組實驗前1 d及同時間點比較，模型組、針刺組及美多芭組小鼠爬桿實驗評分均下降(P<0.05，P<0.01)，表明腹腔注射MPTP后小鼠動作協調性受到破壞，PD模型建立成功；與模型組比較，針刺組及美多芭組小鼠在接受干預后爬桿實驗得分均呈增長趨勢(P<0.05)；而針刺組與美多芭組進行比較則無差異(P>0.05)。具體比較結果見表3。

表3 各組爬桿實驗得分比較分)

注：與空白組實驗前1 d比較，*P<0.05；與空白組同時間點比較,△P<0.05;與模型組比較，#P<0.05

2.1.2 懸掛實驗得分比較

與空白組實驗前1 d及同時間點比較，模型組、針刺組及美多芭組小鼠懸掛實驗評分均下降(P<0.05，P<0.01)，表明腹腔注射MPTP后小鼠動作協調性受到破壞，PD模型建立成功；與模型組比較，針刺組及美多芭組小鼠在接受干預后懸掛實驗得分均呈增長趨勢(P<0.05)；而針刺組與美多芭組進行比較則無差異(P>0.05)。結果見表4。

表4 各組懸掛實驗得分比較分)

注：與空白組實驗前1 d比較，*P<0.05；與空白組同時間點比較,△P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

以上行為學實驗結果表明，針刺及美多芭均有輔助PD小鼠動作協調性恢復的作用，效果大致相當。

2.2 PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白表達

分析圖1 PI3K蛋白條帶可知，PD建模成功后PI3K蛋白表達均快速上升，經針刺及美多芭干預后PI3K蛋白表達均有不同程度的下降。分析圖2 p-Akt(Ser473)蛋白條帶可知，PD建模成功后p-Akt(Ser473)蛋白表達均快速下降，經針刺及美多芭干預后p-Akt(Ser473)蛋白表達均有不同程度的上升。

圖1 各組PI3K蛋白條帶

圖2 各組p-Akt(Ser473)蛋白條帶

3 討論

PD患者臨床主要表現為靜止性震顫、行動遲緩及肌強直等運動障礙癥狀。現代醫學認為，選擇性的腦黑質多巴胺能神經元喪失、紋狀體多巴胺含量顯著減少及黑質和藍斑存在Lewy小體為PD主要病理特征[7]。

PD屬中醫“顫證”范疇，其病位腦，基本病機為肝腎陰虛，髓海不足，虛風內動。臨床上頭針在PD治療方面有著較好療效。針刺位于腦部巔頂正中的百會穴，可以起到調神健腦、疏通局部經絡氣血的作用[8],有通絡醒腦、調神治病之功效[9]；有研究表明[10]，針刺舞蹈震顫區可改善PD小鼠運動障礙癥狀，并可明顯減少中腦多巴胺神經元的丟失；風池熄風止顫[11]。諸穴合用，激發頭部經氣，平衡陰陽，調整全身經絡氣血，進而改善全身癥狀。現代研究亦表明[12]，頭針可以提高黑質多巴胺能神經元含量、減少黑質細胞的凋亡，改善PD引起的運動癥狀,進而延緩病情進展,提升患者的生活質量。

目前國內外較為公認的PD建模方法為MPTP誘導法。MPTP作用于C57BL/6品系小鼠黑質紋狀體多巴胺能神經元，進而產生毒性作用，因此產生類似于人類PD的典型臨床癥狀，總體表現為運動協調能力的下降[13-16]。在研究選用觀察了PD小鼠不同時期爬桿實驗與懸掛實驗的評分結果，以此來從行為學的角度評估不同的干預方法對PD小鼠運動遲緩程度及運動平衡能力的影響情況[17]。實驗結果顯示，頭針針刺與美多芭灌胃均可在一定程度上改善PD小鼠運動遲緩的癥狀、提升其運動平衡的能力，且兩組效果大致相當。

PI3K-AKT是調節細胞存活的重要信號轉導通路，是目前已知的作用最強、爭議最少的抗凋亡途徑之一。該通路抑制凋亡的關鍵作用主要體現在通路激活及下游信號的級聯反應上[18-20]。Akt被認為是促進細胞存活的因子，為PI3K的主要靶蛋白之一[21]。Kroner[22]等研究發現，Akt活性的最終實現需要Ser473位點的磷酸化，故而很多研究把測定p-Akt(Ser473)水平作為Akt活化的主要標志。本研究中，PD建模成功后PI3K蛋白表達快速上升，p-Akt(Ser473)蛋白表達快速下降；經針刺及美多芭干預后PI3K蛋白表達均有不同程度的下降、p-Akt(Ser473)蛋白表達均有不同程度的上升。表明頭針針刺可以通過激活PI3K-AKT信號通路、調節PI3K及p-Akt(Ser473)蛋白水平來抗細胞凋亡，即PI3K表達水平越低、p-Akt (Ser473) 表達水平越高，則凋亡細胞數越少。

表面看來，在抗細胞凋亡、改善PD小鼠的運動遲緩的癥狀、提升其運動平衡的能力方面，頭針針刺效果與西藥美多芭大致相當。但長期服用美多芭不僅費用高昂，更會產生肝腎臟損傷、精神障礙等副作用，比較而言，頭針針刺更為安全可靠，操作可重復強，值得臨床推廣。