胡桃醌通過調節(jié)NF-κB/Snail通路抑制卵巢癌細胞上皮間質轉化

鞠曉紅，徐海月，李 強，陳 爽，方 芳 (吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林 吉林 132013)

卵巢癌是常見的惡性生殖器腫瘤，極易發(fā)生侵襲轉移，初診時75%的患者已屬于晚期[1]。上皮-間質轉化(epithelial-to-esenchymal transition,EMT)是指上皮細胞在正常生理和特定病理情況下向間質轉化的現(xiàn)象，上皮細胞失去了細胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得間質表型，使細胞獲得較高的遷移與侵襲能力[2]。目前，臨床針對卵巢癌的治療主要采用手術治療聯(lián)合鉑類化療作為治療手段，但是發(fā)生耐藥是卵巢癌治療失敗的重要因素[3]。因此，尋找有效治療卵巢癌的藥物至關重要。胡桃醌是從核桃楸中提純的一種天然成分，具有抗腫瘤的作用。前期研究結果表明，胡桃醌具有抑制卵巢癌SKOV3細胞黏附和侵襲作用[3]，是否胡桃醌具有抑制卵巢癌細胞EMT的作用還不清楚。本研究利用胡桃醌作用卵巢癌細胞，明確胡桃醌對卵巢癌細胞的EMT作用，并探討其作用機制，積極發(fā)現(xiàn)抑制卵巢癌細胞EMT的有效藥物，對于提高卵巢癌的療效十分重要。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人卵巢癌SKOV3細胞購自上海中科院細胞庫；胡桃醌(美國Sigma公司)；兔抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、Snail、NF-κB p65、β-actin和Histon H抗體和NF-κB通路抑制劑PDTC(美國Cell Signaling Technology公司)。細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)；Western blotting系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；生物顯微鏡(日本Olympus公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國BioRad公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

將人卵巢癌細胞SKOV3細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清IMDM培養(yǎng)液中，隔日換液，選擇生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞進行實驗。

1.3 細胞劃痕法檢測細胞遷移率

細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞匯合率達80%左右時，用滅菌的200 μL槍頭垂直均勻地劃出1條筆直的無細胞的劃痕；PBS洗2次，然后根據(jù)前期實驗結果的IC50值選擇加入20 μmol/L胡桃醌培養(yǎng)液[5]，以減少由于藥物引起的細胞凋亡造成對實驗的影響。同時設陰性對照孔，顯微鏡下記錄位置并拍照，記該點為0 h。37 ℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h；取出6孔細胞培養(yǎng)板，顯微鏡下原位點拍照，記該點為24 h。使用Image J軟件分析每個圖片無細胞區(qū)域面積，劃痕閉合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/(0 h劃痕面積)×100%，重復3次。

1.4 免疫印跡法檢測EMT相關蛋白及NF-κB-p65和Snail的表達

終濃度為20 μmol/L胡桃醌作用細胞24 h，加入細胞裂解液，用細胞刮器刮取細胞，4 ℃超聲裂解細胞，分別提取細胞總蛋白和細胞核蛋白，收集上清液測蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE，并轉移到PVDF膜上。室溫下PVDF膜在封閉緩沖液中2 h，加兔抗E-cadherin、N-cadherin、NF-κB-p65、Snail抗體(1∶1000)、β-actin和Histon H抗體(1∶4000)4 ℃過夜。次日TBST洗膜，分別加HRP標記的山羊抗兔抗體(1∶4000)，室溫避光孵育2 h。TBST洗膜，加底物發(fā)光顯影。使用Quantity One軟件掃描并做灰度分析。

1.5 統(tǒng)計方法

應用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 胡桃醌對SKOV3細胞遷移率影響

與對照組劃痕閉合率(74.4±9.2)%比較，胡桃醌作用細胞后更少的細胞向劃痕中央聚集，劃痕閉合率為(40.6±4.7)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。

陰性對照組 胡桃醌組

2.2 胡桃醌對SKOV3細胞EMT相關蛋白表達影響

結果顯示，對照組和20 μmol/L胡桃醌作用細胞24 h后E-cadherin表達分別是(0.31±0.04)和(0.45±0.05)；N-cadherin表達分別是(0.44±0.03)和(0.22±0.02)。與對照組比較，胡桃醌組的E-cadherin表達升高(P<0.05)、N-cadherin表達降低(P<0.01)。

陰性對照組 胡桃醌組

圖 2 胡桃醌對SKOV3細胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表達影響

2.3 胡桃醌通過NK-κB途徑抑制SKOV3細胞EMT

Western blotting檢測陰性對照組和胡桃醌組細胞NK-κB p65和Snail的表達。結果表明，陰性對照組的NF-κB p65和Snail的表達分別是(0.84±0.04)和(0.43±0.03)；胡桃醌組NF-κB p65和Snail的表達分別是(0.57±0.02)和(0.21±0.03)。與陰性對照組比較，胡桃醌組的NF-κB p65和Snail的表達下降(P<0.05，P<0.01)(圖3)。表明胡桃醌可能通過NF-κB信號途徑抑制SKOV3細胞的EMT作用。

為了進一步證實NF-κB信號通路參與胡桃醌抑制SKOV3細胞的EMT作用，NF-κB途徑抑制劑吡咯二硫氨基甲酸酯10 μmol/L(PDTC)與胡桃醌作用，Western blotting檢測Sanil的表達。結果顯示，與胡桃醌組Snail蛋白表達(0.62±0.02)比較，胡桃醌與PDTC聯(lián)合作用細胞后Snail蛋白表達(0.1±0.01)下降(P<0.01)(圖4)。

陰性對照組 胡桃醌組

圖 3 胡桃醌對SKOV3細胞NF-κB p65和Snail蛋白表達影響

圖 4 PDTC促進胡桃醌抑制Snail蛋白表達

3 討 論

腫瘤轉移是復雜過程。其中，腫瘤細胞脫離原發(fā)病灶并獲得侵襲能力是腫瘤轉移的第一環(huán)節(jié)。EMT是指上皮細胞向間質轉化的現(xiàn)象。間質表型能增加細胞遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力。EMT的發(fā)生伴隨上皮標志物E-cadherin、緊密連接蛋白ZO-1、β-連環(huán)素等表達下調；間質標志物波形蛋白、N-cadherin等表達上調。其中E-cadherin的表達下降在EMT的發(fā)生中至關重要[6]。胡桃醌是從核桃楸中提純的一種天然成分，具有抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移的功能[7-8]。本研究結果表明，胡桃醌作用卵巢癌SKOV3細胞可以抑制細胞遷移、使E-cadherin表達升高而N-cadherin表達下降的作用,表明胡桃醌具有抑制卵巢癌SKOV3細胞EMT的作用。

EMT的調控機制復雜，多種生長因子、轉錄因子和信號通路參與EMT的調節(jié)，其中Snail是重要調節(jié)EMT的轉錄因子。Snail可以結合到E-cadherin基因的啟動子近端部位的E-box序列，進而抑制其表達水平，從而導致EMT現(xiàn)象的發(fā)生[9]。NF-κB作為轉錄因子與腫瘤的發(fā)生、生長和轉移等多個過程密切相關。P65是NF-κB一個亞基，其激活后由細胞質進入細胞核，具有促進細胞增殖和抑制凋亡等作用[10]。NF-κB信號通路是卵巢癌細胞促進化療耐藥、腫瘤細胞轉移和免疫逃逸的主要掌控者[11]。Snail作為重要的EMT轉錄因子可以被NF-κB調節(jié)。NF-κB可以作用在Snail的啟動子區(qū)增加Snail的轉錄[12]。本研究結果表明，胡桃醌能夠抑制SKOV3細胞NF-κB p65和Snail表達。

為了進一步驗證胡桃醌通過NF-κB途徑抑制卵巢癌細胞EMT的作用，研究使用了NF-κB途徑激活劑PDTC處理SKOV3細胞。結果發(fā)現(xiàn)，PDTC能夠進一步抑制Snail蛋白的表達。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌可能通過抑制NF-κB/Snail信號通路降低卵巢癌細胞EMT的發(fā)生，從而減少卵巢癌細胞侵襲。本研究明確胡桃醌抑制卵巢癌細胞侵襲轉移作用，為卵巢癌的臨床研究和治療提供一定的理論基礎。