堿性體系下美拉德反應產物中關鍵香味成分的種類及質量分數

朱龍杰，張 華，吳 洋，陳晶波，曹 毅，廖惠云，王 瑞，朱懷遠，沈曉晨，毛淑蕊

江蘇中煙工業有限責任公司技術中心，南京市興隆大街29 號 210019

美拉德反應是由氨基酸和還原糖或其他羰基化合物之間發生的一系列反應的總稱，反應產物具有一定風格及香味特征，很多具有自然優美、令人愉悅的香氣，同時還含有還原酮等活性物質，具有抗氧化抗自由基能力，因此美拉德反應產物在香料、食品、煙草、制藥等領域均有重要應用［1-7］。關于美拉德反應產物的研究，主要集中在反應動力學機理研究、反應條件優化、產物的檢測分析、香氣的感官評價及加香應用等方面［8-20］。

對于美拉德反應的研究，前人主要集中在反應溫度、反應時間、體系水分、體系pH 等反應條件的優化研究方面［9-13］。一般認為反應體系pH 升高，會促進美拉德反應進行［13］。但是文獻［21-22］報道，隨美拉德反應的進行，初始呈堿性的美拉德反應液會迅速地變為酸性。盡管這種現象在一些研究中被較多提及，但相應的維持堿性條件的探索嘗試卻較少，也未有比較不同堿性體系下美拉德反應體系pH 變化的研究。而對于美拉德反應產物主要成分的種類和質量分數的分析，還較多地停留在定性階段［10-11，14-17］，開展美拉德反應產物香味物質定量的工作較少，且少數定量研究一般只選擇某些特定的美拉德產物進行分析［12，18］，鮮見有全面開展針對美拉德反應產物中關鍵香味物質種類和質量分數研究的文獻報道。此外，對于一些只選擇少數幾種糖和氨基酸為原料制備美拉德反應產物并進行檢測分析或應用的研究［17-20］，由于此類方法沒有完整地研究美拉德反應產物，因此難以深入探討美拉德反應產物中香味物質的形成機制，也無法系統獲知美拉德反應產物中香味物質種類和質量分數的分布規律。

本研究中以不同糖類和氨基酸的反應產物為研究對象，通過優化反應條件，建立合適的美拉德反應產物制備方法，研究不同糖類和氨基酸美拉德反應產物中關鍵香味成分的種類和質量分數，并重點分析了美拉德反應產物中香味物質質量分數的分布規律，旨在為香料和食品行業等準確評價和應用美拉德反應產物提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

D-葡萄糖、D-果糖、D-木糖、D-脫氧核糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、L-甘氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-半胱氨酸（BR），氫氧化鈉、碳酸鉀、丙二醇（AR）（國藥集團化學試劑有限公司）；丙酸苯乙酯（＞97%，阿法埃莎化學有限公司）；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）。

ME203 電子天平（感量0.001 g）、S210 型pH 計（分 辨 率0.001）（瑞 士Mettler Toledo 公 司）；ZNCL-G 型智能恒溫磁力攪拌器（河南愛博特科技發展有限公司）；R215 型旋轉蒸發儀（瑞士Büchi 公司）；6890N-5975C 型氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；0.22 μm 有機相濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 美拉德反應產物的制備

稱取5 mmol 糖和5 mmol 氨基酸，加入50 mL圓底燒瓶中，再加入2.5 mmol 碳酸鉀（當氨基酸為天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和酪氨酸時，碳酸鉀的量為5 mmol）使反應液的pH 維持在9～10。以20 mL 丙二醇和5 mL 超純水的混合液作為反應溶劑，升溫加熱至100 ℃，反應6 h。

1.2.2 兩種美拉德反應體系下pH 的檢測

校正pH 計，使測量范圍為pH 3.00～10.00，采用兩種方法對美拉德反應體系pH 的變化情況進行監測：一種方法是采用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調節反應液初始pH 至9～10，然后加入同一糖類和不同氨基酸進行美拉德反應；另一種方法是根據同一糖類和不同氨基酸的物質的量，加入一定量的碳酸鉀使反應液的pH 至9～10 后進行美拉德反應。反應結束后，使用pH 計檢測反應液的pH。

1.2.3 美拉德反應產物中香味成分的GC-MS 檢測與分析

取2 mL 美拉德反應液加入分液漏斗中，加入100 μL 內標濃度為1 mg/mL 的丙酸苯乙酯二氯甲烷溶液和15 mL 超純水，用二氯甲烷（20 mL×2）萃取。合并有機相，加入無水硫酸鈉干燥。過濾后，將濾液減壓濃縮至1 mL，過0.22 μm 有機相濾膜，采用GC-MS 法進行分析。分析條件：

色譜柱：Agilent DB-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.）；進樣口溫度：260 ℃；載氣：He；載氣流速：1.0 mL/min；進樣量：1 μL；分流比：10 ∶1；升 溫 程序：60 ℃（1 min）10 ℃/min 280 ℃（15 min）；傳輸線溫度：280 ℃；MS 電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描范圍：30～450 amu；溶劑延遲：3 min。

采用Nist14 和Wiley 標準質譜圖庫檢索定性，以匹配度≥85%認為可信。以添加的丙酸苯乙酯為內標物質，假定檢出的香味物質校正因子為1，回收率為100%，利用公式（1）計算美拉德反應產物樣品中某一待測香味成分的質量，利用公式（2）計算美拉德反應產物中香味成分的總質量。

其中：Mi—待測香味成分的質量；Ms—內標物質的質量；Ai—待測香味成分的峰面積；As—內標物質的峰面積；MT—美拉德反應產物中香味成分總質量。

2 結果與討論

2.1 兩種美拉德反應體系中pH 的變化對比

為了對比使用氫氧化鈉和碳酸鉀對維持美拉德反應體系pH 的效果，選擇以葡萄糖和不同氨基酸為原料進行美拉德反應，反應結束后檢測每種氨基酸美拉德反應產物反應液的pH，結果如表1所示。可知，當采用氫氧化鈉時，美拉德反應末期反應液的pH 幾乎均從堿性變為酸性。其原因可能是由于美拉德反應體系中不斷地生成酸性物質，中和了體系的堿性，并且有些氨基酸的pKa值較低，也會促進反應體系pH 轉為酸性，因此采用氫氧化鈉調節美拉德反應液初始pH 為堿性的方法難以真正維持反應液體系為堿性。當采用碳酸鉀時，美拉德反應末期反應液的pH 均能維持在堿性。原因可能是由于碳酸鉀為中等堿性物質并能起到持續中和作用，且可以根據原料的量按照一定比例添加而不會造成反應液的堿性過強。隨著美拉德反應的進行，生成的酸性物質不斷被中和，但只要碳酸鉀的量足夠，溶液就會維持堿性環境，美拉德反應將不會受到抑制。因此，采用定量添加碳酸鉀的方法可以有效維持美拉德反應在堿性環境下進行，比添加氫氧化鈉調節反應液初始pH為堿性的方法更能有效地促進美拉德反應。

2.2 4 種糖類與多種氨基酸美拉德反應產物中關鍵香味成分的鑒定

在美拉德反應糖類原料中，最常見的為五碳糖和六碳糖，其中有不少物理和化學性質相似的異構體。由于異構體糖類的反應活性和反應產物較為接近，因此選擇兩兩非異構體葡萄糖、果糖、木糖和脫氧核糖作為美拉德反應的糖原料。將葡萄糖、果糖、木糖和脫氧核糖分別與20 種氨基酸進行兩兩組合反應，共得到80 種美拉德反應的產物。

對80 種美拉德反應產物進行GC-MS 定性分析，鑒定出的主要成分有雜環類、芳香族類、烯酮（醛）類、醇類、醚類、大分子脂肪族化合物等。其中，雜環類、芳香族類和烯酮（醛）類化合物具有典型香氣特征［23-26］。由于以上3 大類物質的種類和質量分數相對較多且具有香味化合物相似的特征分子骨架，因此選定雜環類、苯環類和烯酮（醛）類化合物作為關鍵香味成分研究對象，其中雜環類化合物包括氮雜環、氧雜環和硫雜環3種。

表1 葡萄糖美拉德反應末期反應液pH 對比Tab.1 Solution pH values at the end of Maillard reaction by glucose

美拉德反應產物中檢測出的含氮雜環化合物是種類和質量分數最豐富的化合物，主要有吡咯類（10 種）、吡啶類（6 種）、吡嗪類（32 種）。含氮雜環類化合物存在于絕大多數的美拉德反應產物中，經鑒定出的氮雜環化合物共有48 種，其分子結構如圖1 所示。美拉德反應產物中檢測出的含氧雜環化合物種類和質量分數不多，主要有呋喃類（3 種）、呋喃酮類（1 種）和麥芽酚類化合物（1種），主要存在于葡萄糖和果糖類美拉德反應產物中。美拉德反應產物中檢測出的含硫雜環化合物種類和質量分數很少，僅有噻唑類1 種，只存在于半胱氨酸美拉德反應產物中。經鑒定出的含氧雜環和含硫雜環化合物共有6 種，其分子結構如圖2所示。在美拉德反應產物中，檢測出的芳香族類化合物種類和質量分數較少，主要為醇類化合物（2 種）、醛類化合物（2 種）、酮類化合物（1 種），主要存在于含苯環的氨基酸美拉德反應產物中，經鑒定出的芳香族類化合物共有4 種，其分子結構如圖3 所示。在制備的美拉德反應產物中，檢測出的烯酮（醛）類化合物種類和質量分數較豐富，主要為開鏈烯酮（醛）類（3 種）和閉環烯酮類（3種）化合物，主要存在于亮氨酸和異亮氨酸等特定的美拉德反應產物中，經鑒定出的烯酮（醛）類化合物共有6 種，其分子結構如圖4 所示。

圖1 美拉德反應產物中的含氮雜環化合物Fig.1 Structures of nitrogen-containing heterocyclic compounds produced by Maillard reaction

圖2 美拉德反應產物中的含氧和含硫雜環化合物Fig.2 Structures of oxygen-and sulfur-containing heterocyclic compounds produced by Maillard reaction

圖3 美拉德反應產物中的芳香族類化合物Fig.3 Structures of aromatic compounds produced by Maillard reaction

圖4 美拉德反應產物中的烯酮（醛）類化合物Fig.4 Structures of ketene and enal compounds produced by Maillard reaction

2.3 4 種糖類與多種氨基酸美拉德反應產物中關鍵香味成分的總質量

對美拉德反應產物譜圖中的所有成分先逐一進行標準譜庫檢索定性，再選擇美拉德反應產物中的雜環類、芳香族類、烯酮（醛）類化合物3 大類關鍵香味成分進行定量分析，最后根據公式（1）和公式（2）計算得到美拉德反應產物中80 種關鍵香味成分的總質量，結果見表2。

表2 美拉德反應產物中關鍵香味成分的總質量①Tab.2 Total contents of key aroma components in Maillard reaction products （mg）

表2 中除列出了每個美拉德反應對應產物中香味物質的總質量，還分別橫向和縱向統計了4種糖類和同一種氨基酸美拉德反應產物中關鍵香味成分總質量之和以及不同氨基酸與同一糖類美拉德反應產物中關鍵香味成分總質量之和，用于輔助分析糖類和氨基酸的反應活性以及美拉德反應產物中關鍵香味成分質量大小的內在規律。在美拉德反應產物關鍵香味成分總質量之和的橫向比較中，4 種糖類的美拉德反應產物香味成分總量為果糖＞＞木糖＞葡萄糖＞脫氧核糖。

美拉德反應產物關鍵香味成分總質量之和的縱向比較結果表明，不同氨基酸美拉德反應產物關鍵香味成分質量差別較為明顯，按照質量多少將其分為3 個檔次：第一檔總質量ΣMT≥30 mg，對應的4 種氨基酸原料分別為亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和色氨酸；第二檔總質量10 mg≤ΣMT＜30 mg，對應的9 種氨基酸原料分別為丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、組氨酸、異亮氨酸和蛋氨酸；第三檔總質量ΣMT＜10 mg，對應的7 種氨基酸原料分別為甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。

2.4 糖類和氨基酸影響美拉德反應中關鍵香味成分總質量的機制探討

根據文獻［9-10］報道，不同的糖原料進行美拉德反應活性大小的順序是木糖＞核糖＞阿拉伯糖＞山梨糖＞葡萄糖＞果糖，其中五碳糖的反應活性高于六碳糖，葡萄糖的反應活性高于果糖。盡管糖類的反應活性大小可以通過反應液色澤及吸光度判斷，但美拉德反應產物中關鍵香味成分的生成情況還需進一步通過檢測分析進行判斷。從表2 可知，美拉德反應產物中關鍵香味成分的總質量與糖類的反應活性并不正相關。其原因在于，美拉德反應是一個復雜的反應體系，一些香味成分的產生與糖類的分子結構和反應中間體構型緊密關聯［14］。在反應中，如果產生的中間體結構不利于香味成分分子結構的生成，那么最終得到的香味成分總質量就會減少，如一些重要的雜環類化合物。

由于吡嗪類氮雜環化合物在多種美拉德反應產物的香味成分中占主導地位，故可對吡嗪類香味成分的形成機制進行重點分析。根據本研究的數據結合文獻中有關美拉德反應中間體的研究結果［27-30］，分析了糖類在美拉德反應中形成吡嗪類化合物的反應機制，其重要中間體二羰基化合物的反應路線如圖5 所示。首先，果糖先與氨基酸生成果糖胺，然后果糖胺經過一系列Heyenes 重排、1,2-重排反應和脫氨基后生成活潑性高且更容易進行反應的含醛基的二羰基化合物，接著二羰基化合物與氨基酸作用進行Strecker 降解生成活潑的氨基酮，最后氨基酮之間縮合生成吡嗪類雜環化合物。而由葡萄糖生成的葡萄糖胺經過Amadori 重排、2,3-重排反應和脫氨基后生成含酮基的二羰基類化合物，該類二羰基化合物由于反應活性較低，繼續反應生成吡嗪類雜環化合物的質量分數較少。因此，盡管果糖是酮糖，葡萄糖、木糖、脫氧核糖是醛糖，且初期生產糖胺的活性順序是醛糖大于酮糖，但在后期通過中間體二羰基化合物生成氨基酮的容易程度卻是酮糖大于醛糖。因此以果糖為原料的美拉德反應產物中吡嗪類關鍵香味成分的質量分數最高。

圖5 葡萄糖和果糖美拉德反應中二羰基化合物的生成機制［27-30］Fig.5 Formation mechanisms of dicarbonyl compounds formed in Maillard reactions by glucose and fructose

美拉德反應中另一主要原料氨基酸由于取代基R 的不同，造成氨基酸的物理性質和化學活性各不相同，對美拉德反應中香味物質的生成也有較大影響。從不同氨基酸美拉德反應產物中關鍵香味成分的總質量比較中可以看出，美拉德反應產物中關鍵香味成分總質量較小的氨基酸有以下幾個特點：①R 的碳鏈太短（甘氨酸）或太長（精氨酸）；②R 中含有羥基或巰基（絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）；③氨基酸分子中可形成閉環結構（脯氨酸）。這些氨基酸分子的空間結構和反應活性或許是美拉德反應中一些重要中間體形成的不利因素，影響美拉德反應產物中一些關鍵香味成分的生成，造成關鍵香味成分的總質量偏低。

3 結論

①建立了堿性體系的美拉德反應產物制備方法。②對所制備的80 種美拉德反應產物進行GC-MS 定性分析，共鑒定出含氮雜環化合物48種，含氧雜環化合物5 種，含硫雜環化合物1 種，芳香族類化合物4 種，烯酮（醛）類化合物6 種。③在眾多關鍵香味成分中，含氮雜環化合物種類多、質量分數大，存在于絕大多數的美拉德反應產物中；含氧雜環化合物種類和質量分數較少，主要存在于葡萄糖和果糖類美拉德反應產物中；含硫雜環化合物種類和質量分數很少，只存在于半胱氨酸的美拉德反應產物中；芳香族類化合物和烯酮（醛）類化合物種類和質量分數均較少，存在于一些特定氨基酸的美拉德反應產物中。④糖類美拉德反應產物關鍵香味成分總質量大小為果糖＞＞木糖＞葡萄糖＞脫氧核糖。⑤不同氨基酸美拉德反應產物中關鍵香味成分總質量差別明顯，其中總質量較高的氨基酸有亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。