合成基因IL-6在大腸桿菌中表達及融合蛋白鑒定分析

唐維政 孫鴻高 陳少文 汪凡 朱中元

(海南醫學院第二附屬醫院檢驗科,海南 海口 570311)

臨床上對細菌引起的感染性疾病的診斷“金標準”是細菌培養,但細菌培養周期長,一般3～5天才有結果,而且血培養陽性率低,還可能因污染菌造成假陽性。因此,僅靠細菌培養無法實現對細菌引起的感染性疾病的早期診斷,受細菌感染的患者尤其是重癥患者也就不能及時得到抗生素治療。近年來,白細胞介素6(IL-6)、降鈣素原(PCT)、C-反應蛋白(CRP)和血清淀粉樣蛋白A(SAA)等感染指標的血清學檢驗已越來越引起臨床的重視,成為了對感染性疾病早期診斷和鑒別診斷的新手段[1-4],有效地彌補了細菌培養周期長等缺陷。

目前,國內已普遍采用免疫熒光法或免疫膠體金法快速測定PCT、CRP和SAA,以滿足急診患者診療需求。而IL-6的檢測主要為化學發光法和酶聯免疫法,這兩種方法對于基層醫院和偏遠地區小型醫院不適用。我們試圖開發一種IL-6、PCT、CRP和SAA膠體金聯合快速檢測系統,為沒有先進檢測設備的醫療機構對急診患者細菌感染的早期診斷、合理使用抗菌藥物及療效評估提供血清學依據。本實驗對IL-6原核蛋白在大腸桿菌中表達及純化,為探索建立血清IL-6快速測定方法奠定前期實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質粒與菌株 pCzn1 質粒、TOP10 克隆菌株及表達菌株Arctic-ExpressTM均由南京淘普生物技術有限公司提供。

1.1.2主要試劑 限制性內切酶NdeI和XhoI購自寶生物工程(大連)有限公司,Pfu DNA聚合酶購自南京淘普生物技術有限公司(貨號PC12)。胰蛋白胨、酵母粉購自英國OXOID公司,瓊脂糖購自上海基因公司。DNA膠純化試劑盒、質粒小提試劑盒購自美國AXYGEN公司。

1.2方法

1.2.1IL-6基因合成 根據基因庫IL-6蛋白的基因序列,由南京淘普生物技術有限公司采用基于 PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法,設計全長拼接引物,在引物的兩端各設計了保護性堿基合成基因IL-6。

1.2.2重組質粒pCzn1-IL-6構建 使用限制性內切酶NdeI和XhoI分別對合成基因PCR回收產物和pCzn1空載體進行雙酶切 ,酶切后產物經瓊脂糖凝膠電泳后回收純化進行連接反應,按10 μL反應體系:10×連接緩沖液1 μL、pCzn1質粒1μL、PCR產物4 μL、T4DNA連接酶1 μL,去離子水補充至10 μL。混勻后瞬時離心,置22 ℃過夜連接。連接產物化學法轉化入TOP10 克隆菌株,使用含終濃度為50 mg/L氨芐西林的LB平板進行篩選,挑選PCR陽性克隆送南京淘普生物技術有限公司測序。

1.2.3質粒酶切鑒定 以限制性內切酶NdeI和XhoI對重組質粒進行切割,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測pCzn1線性化載體和IL-6插入基因的大小。酶切體系：質粒：3 μL,內切酶1：0.25 μL,內切酶2 ：0.25 μL,10×Buffer：1.0 μL,雙蒸水加至10μL。

1.2.4原核蛋白的誘導表達及鑒定 將pCZN1 -IL-6載體轉化至大腸桿菌Arctic Express ：將質粒1 μL加入100 μL感受態細菌中,置冰上20 min；42 ℃熱激90 s,迅速置冰中5 min；加入600 μL LB培養液；37 ℃,220 r/min振搖1 h,離心后全部涂布于含50 μg/mL Amp的LB平板,37 ℃倒置培養過夜。IPTG誘導pCZN1 -IL-6載體原核蛋白的表達：挑取轉化平板上的單克隆接種于3 mL LB培養液的試管中,37 ℃振搖過夜；次日按1∶100接種于30 mL LB培養液中,37 ℃ 振搖至菌體OD600為0.6～0.8；取出1 mL培養物離心棄上清,用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀；向剩余的培養物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,37 ℃ 220 r/min振搖4 h,誘導融合蛋白表達；取出1 mL培養物,室溫離心棄上清,用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀,剩余培養物離心棄上清,用 PBS重懸菌體沉淀,重懸液進行超聲波破碎后,分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸；進行12% SDS-PAGE檢測分析,考馬斯亮藍染色顯帶。

1.2.5原核蛋白的Ni柱親和純化及結果分析 上述誘導表達后的菌液Ni柱純化：利用低壓層析系統按照其說明書進行純化,對純化樣品進行12% SDS-PAGE及Western Blot鑒定。

2 結 果

2.1pCzn1-IL-6測序驗證 重組質粒pCzn1-IL-6化學法轉化入TOP10 克隆菌株,使用LB平板進行篩選,挑選PCR陽性克隆送南京淘普生物技術有限公司測序,測序結果與預期序列一致,證實插入基因序列正確,無突變、缺失,可以確定pCZN1 -IL-6原核表達質粒構建成功。測序結果與預期序列進行比對。見圖1。

圖1 部分序列比對結果圖

2.2質粒酶切鑒定 重組質粒經雙酶切后,經瓊脂糖凝膠電泳鑒定,IL-6基因片段在500 bp稍上位置,與預期目的片段550 bp相符(圖2)。

注：Marker: 200,500,800,1200,2000,3000,4500；基因名稱：IL-6(OD260/OD280:1.82)；酶切鑒定：NdeI - XhoI； M:Marker；Line1:酶切前質粒；Line2: 酶切后質粒圖2 質粒酶切鑒定

2.3原核蛋白的誘導表達及鑒定 pCZN1 -IL-6重組質粒轉化至大腸桿菌Arctic Express, 利用終濃度0.5 mmol/L IPTG誘導蛋白表達,培養物經12% SDS-PAGE分析。誘導后在目的蛋白約24.15KD 區域有明顯的特異條帶,未誘導的菌株無特異的表達條帶,目標蛋白主要存在于沉淀中,說明原核蛋白的誘導表達成功。在誘導破碎后上清和沉淀中都有目的條帶,說明IL-6蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在于表達菌中,主要以包涵體形式存在。見圖3。

注：M:蛋白質分子質量標準, 1: 未誘導；2: 誘導后；3: 誘導破碎后上清；4: 誘導破碎后沉淀圖3 蛋白表達鑒定SDS-PAGE分析

2.4原核蛋白Ni柱純化及結果分析 包涵體經過變復性的方式,重溶目標蛋白,通過Ni柱親和純化獲得目標蛋白,進行12% SDS-PAGE分析,結果見圖4。

注：M:蛋白質分子質量標準；1: 破碎后處理樣品；2: 流出；3: 洗脫圖4 蛋白純化SDS-PAGE分析

2.5Western Blot結果分析 取純化樣品5 μl經聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜,再經一抗和二抗反應,最后ECL顯影,曝光。在14～25 KD之間有明顯的曝光條帶,目的蛋白為24.15 KD。Western Blot檢測結果結果見圖5。

注：M:蛋白質分子質量標準 1: 純化后樣品圖5 蛋白Western Blot鑒定分析

3 討 論

IL-6是細胞因子之一,具有多種生物活性,由多種組織細胞產生,可以調節免疫應答、急性期反應以及造血功能等,在眾多疾病中發揮著重要作用[5]。炎癥反應發生后,IL-6率先生成,檢測血清中IL-6濃度可用來輔助急性感染的早期診斷。IL-6半衰期僅1h,在感染控制后其血清濃度下降更快、幅度更大,能更快地反映抗生素治療的效果。有研究報告IL-6還是急危重癥患者感染嚴重程度及病情預后評估的良好指標[6-7]。研究表明,盡管單獨的IL-6血清學檢驗有重要臨床價值,但其他非感染因素也可致IL-6升高[8],其與PCT、CRP及SAA等感染指標聯合檢測對臨床評估患者并發細菌感染時具有更佳的評估效能,可彌補各個指標單獨測定的不足,更有助于醫生早期發現感染[9-10],在鑒別診斷、療效監測、預后評估上更有價值[11-13]。目前,抗菌藥物臨床應用管理日趨嚴格和規范化,由于細菌培養耗時較長及用藥后也不適合做細菌培養,故治療中判斷抗生素治療的效果主要靠感染指標的血清學檢驗,對于敗血癥和膿毒血癥等重癥患者來講,快速檢測感染性血清學指標就顯得尤為重要。目前國內PCT、CRP和SAA單個項目的快速測定應用已較為普遍,IL-6的快速測定應用還不多見。我們試圖研制一種IL-6、PCT、CRP和SAA快速聯合檢測卡,生產IL-6純化蛋白用于抗體的制備是首要的任務。

本研究采用大腸桿菌表達系統獲得IL-6的包涵體蛋白。大腸桿菌表達系統是基因工程中較為常用的一種,其優點是遺傳背景比較清楚,表達水平較穩定,操作相對容易,實驗成本低,蛋白表達量高及容易純化等。本實驗采用基于 PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法,設計全長拼接引物,通過PCR得到了IL-6合成基因,并將其插入原核表達質粒pCZN1,構建了重組表達載體pCZN1 -IL6。克隆菌株經測序和載體的雙酶切證明構建的表達載體正確。pCZN1 -IL6重組質粒轉化至大腸桿菌Arctic Express,參照文獻[14-15],利用終濃度0.5 mmol/L IPTG誘導蛋白表達,成功地在大腸桿菌Arctic Express中表達出IL-6蛋白。在誘導表達時,隨著誘導時間的延長,蛋白表達量逐漸上升,至第4 h時表達量最高。該重組蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在,主要以包涵體形式存在,通過Ni柱親和純化獲得分子量24.15KD的目標蛋白。

本研究成功合成IL-6融合蛋白,為下一步抗體制備等后續工作奠定了必要的實驗基礎。