Slit2蛋白在膽囊癌中的表達及其臨床意義

梁剛 王智翔 何盟國 楊學超 郭棟△

(1.陜西核工業二一五醫院 普通外科;2.病理科， 陜西 咸陽 712000)

神經導向因子Slit是一種分泌性糖蛋白，可通過結合神經細胞膜上的Roundabout(Robo)受體家族發揮生物學功能。現有研究發現Slit/Robo信號通路除了能夠誘導神經元軸突(或胞體)遷移外，還參與了腫瘤的發生、發展[1,2]。膽囊癌是膽道系統的惡性腫瘤，有關Slit/Robo信號通路在膽囊癌發生發展中的作用報道甚少，本研究通過測定Slit2蛋白在膽囊癌組織中的表達情況，分析Slit2蛋白與膽囊癌患者臨床特征及預后之間的關系，以期了解Slit /Robo信號通路對膽囊癌發展的作用。報告如下。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取陜西省核工業二一五醫院 2008年1月至2015年12月間行膽囊癌手術治療的石蠟包埋標本80例，其中男性34例， 女性46例， 平均年齡(62±3.25)歲，臨床分期參照第八版外科學教材(2014年)膽囊癌 TNM 分期：Ⅰ期 14例、Ⅱ期 26例、Ⅲ期 35例、Ⅳ期 5 例；伴淋巴結轉移者 38 例；組織學類型分類:腺癌 68例， 鱗癌 12 例。所有病例術前均未接受化放療，術后經病理組織學證實為膽囊癌。另取80例相應癌旁組織作為對照組，癌旁組織均取自距腫瘤邊緣 2 cm 以上無腫瘤組織。

1.2主要試劑 兔抗人Slit2多克隆抗體購自武漢博士德公司， SABC即用型免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購由武漢博士德公司提供。

1.3方法

1.3.1實驗方法 采用免疫組織化學法，切取80例膽囊癌組織及癌旁組織石蠟標本，切片厚度4 μm，將石蠟切片脫蠟至水化；3% H2O2去離子水室溫孵10 min；PBS沖洗(5 min × 3次)；微波修復(0.01 mol/L枸櫞酸鹽，pH 6.0) 20 min；PBS沖洗(5 min × 3次)；5%BSA封閉液37 ℃孵育30 min，甩干；滴加一抗 4 ℃過夜(Slit2 濃度為1∶50)；PBS沖洗(5 min × 3次)；滴加生物素標記的二抗；PBS沖洗(5 min × 3次)；滴加SABC液；PBS沖洗(5 min × 3次)；DAB 顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片，每批實驗以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.3.2Slit2蛋白結果判斷 陽性染色為細胞質內出現棕色顆粒狀，Slit2染色評估是根據每張切片陽性細胞染色強度及陽性細胞百分數進行分級。染色強度分4級：不著色為與背景一致，記為0分；弱染色為淡黃色略高于背景，記為1分；中度染色為黃色，明顯高于背景，記為2分；強染色為棕褐色，記為3分。陽性細胞面積同樣分4級：0%～11%記0分、11%～26%記1分、26%～51%記2分、51%～100%記3分。兩項指標分數相加，總積分為0～2為陰性，3分及以上為陽性表達。

1.3.3生存隨訪 通過患者住院記錄在案的電話進行隨訪，生存時間以手術時間為起點， 2018年12月31日為隨訪時間終點，共隨訪 68例，失訪12例。隨訪患者最短生存時間2月，最長生存時間85月。

1.4統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數或率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1膽囊癌組織及癌旁組織中Slit2的蛋白表達情況 膽囊癌組織中Slit2陽性表達率為57.5%，癌旁組織中Slit2陽性表達率為35.0%。兩者均表現為細胞胞質內出現黃色顆粒或團塊，見圖1、圖2；與癌旁組織相比，Slit2蛋白的表達明顯增高，差異有統計學意義(χ2=8.457，P<0.05)。見表1。

圖1 Slit2在膽囊癌組織中陽性表達 ×100

圖2 Slit2在癌旁組織中陽性表達 ×100

表1 膽囊癌及癌旁組織中Slit2蛋白表達情況(n)

2.2Slit2蛋白表達水平與膽囊癌患者臨床病理特征的關系 膽囊癌TNM分期及淋巴結轉移患者的Slit2蛋白表達水平差異有統計意義(P<0.05) ；患者年齡、性別、膽囊癌病理類型、有無膽囊結石等特征與Slit2蛋白水平的差異均無統計學意義 (P>0.05) 。見表2。

表2 Slit2蛋白表達水平與膽囊癌臨床病理特征的關系(n)

2.3Slit2蛋白表達水平與膽囊癌患者預后的關系 生存分析顯示：Slit2陽性表達組及Slit2陰性表達組的膽囊癌患者術后 3 年生存率分別為 45.5%和64.3%，兩組的中位生存時間分別為：12.0個月和30.0個月，Slit2陽性表達組的患者總生存期明顯低于陰性表達組，差異有統計學意義(χ2=5.229，P=0.022)。

圖3 Slit2蛋白陽性表達組及陰性表達組的生存曲線

3 討 論

Slit蛋白家族是由基因 4p15.2 編碼的大分子量的細胞外分泌蛋白，有Slit1、Slit2、Slit3 3個成員，通過結合跨膜蛋白Robo受體發揮生物學效應。目前研究發現，在Slit/Robo信號通路中，配體Slit蛋白主要通過其結構內富含亮氨酸的重復序列(leucine-rich repeat,LRR)結合受體Robo胞外前兩個免疫球蛋白結構域樣功能區(lg1、lg2)樣功能區，激活Robo受體胞內區域，使其與下游效應物質如：小Rho GTPases等相互作用，發揮復雜的生物學功能[3,4,5]，如神經軸突導向、白細胞趨化性反應[6]、心管的形成[7]、腫瘤的發生發展[8,9,10]、血管損傷及生成[11,12,13]]等。

目前研究發現Slits在多種腫瘤中表達升高，有學者[14]報道Slit2在鱗狀胃癌、肝癌、惡性黑色素瘤、直腸粘液腺瘤等常見腫瘤中有表達。Slit2在惡性黑色素瘤系A375細胞中表達上調，而受體Robo1表達于腫瘤血管內皮細胞上，有學者推測Slit2/ Robo1信號通路參與了惡性黑色素瘤的發病。Slit2、Robo1蛋白在分化狀態差的晚期肝癌細胞上表達上調，通過測量Slit2、Robo1的表達情況可預測腫瘤分期和分化狀態[15]。Slit2、Robo1在小腸癌中過度表達，激活Slit2/Robo1信號通路可誘導小腸粘膜癌變，并通過活化Src信號，下調E黏連蛋白，進而激活Wnt/β-catnin 途徑，促進小腸腫瘤的發生發展[16]。在一些腫瘤中，Slit2在表達上沒有明顯變化，而其受體Robo1在直腸癌細胞中表達水平明顯上調[17]。近年來，關于Slit/Robo信號通路與惡性腫瘤關系的研究越來越受人們重視，但Slit/Robo信號通路與膽囊癌的研究在國內外報道較少。

本研究發現，Slit2 蛋白主要分布于細胞胞質，并且高表達于膽囊癌組織中，差異有統計學意義(P<0.05)，提示膽囊癌中可能存在Slit/Robo信號通路，并且該通路對膽囊癌的發生發展有一定作用。另外，Slit2蛋白在TNM分期較晚、有淋巴結轉移的膽囊癌組織中表達升高,差異有統計學意義(P<0.05)，提示Slit/Robo信號通路可能參與了膽囊癌的侵襲及轉移。通過生存分析發現Slit2陽性表達組患者生存期明顯低于Slit2陰性表達組患者，提示Slit/Robo信號通路可能與膽囊癌患者的生存期密切相關。Y.Shao等[18]研究發現膽囊癌中Slit、Robo1在表達升高，Slit表達與膽石癥和肝臟受累有關，Robo1表達與肝臟受累和病理分期有關，并且Slit表達是Robo1表達的獨立預測因子，盡管我們的研究與Shao等部分結果不一致，但都說明了Slit/Robo信號通路可能對膽囊癌的發生發展有一定作用。

綜上所述，Slit2蛋白與膽囊癌侵襲、轉移及與預后密切相關，Slit2蛋白可能通過Slit/Robo信號通路參與了上述生物學行為，其具體作用及機制仍需要進一步深入研究。