高效液相色譜-四極桿/飛行時間高分辨質譜測定化妝品中的西咪替丁及雷尼替丁

王 聰，董 喆，李 莉，王海燕，孫 磊

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

組胺是人體內源性物質，化學名為4(5)-(2-氨乙基)咪唑，呈堿性。組胺受體有H1、H2、H3亞型，均為G蛋白偶聯受體，受體激活后通過G蛋白介導，作用于蛋白激酶引發生物學反應[1]。西咪替丁和雷尼替丁為組胺H2受體拮抗藥物，能有效降低胃酸，臨床可用于消化性潰瘍的治療。此外，由于該類組胺受體拮抗劑能競爭雙氫睪酮受體，阻斷雙氫睪酮與受體的結合，抑制皮脂分泌，因此可與其他抗菌類、激素類等藥物聯用治療痤瘡等皮膚病[2-3]。由于《化妝品安全技術規范》(2015年版)的禁用組分列表以及禁用組分檢測方法中未包含西咪替丁、雷尼替丁，使得這兩種藥物具有較強的隱蔽性，因而被一些不法商販非法加入到化妝品中，以達到祛痘、平滑肌膚等作用[4]。在化妝品中非法添加此類藥物，可能危害使用者的健康。

目前國內外關于西咪替丁、雷尼替丁的檢測方法主要有高效液相色譜法[5]、氣相色譜法[6]、毛細管電泳法[7]、熒光探針法[8]。高分辨質譜技術的應用和發展，推動了禁限用物質篩查方法的研究。與上述檢測方法相比，高分辨質譜具有更強的抗基質干擾和高通量檢測能力，可有效區分混合物，簡化前處理過程，對色譜的分離要求較低[9]。將四極桿質譜和飛行時間質譜串聯，可對準分子離子和子離子的精確質量數進行分析，比三重四極桿質譜具有更高的分辨率和更好的選擇性[10]。

本研究建立了一種高效液相色譜-四極桿/飛行時間高分辨質譜測定化妝品中2種組胺H2受體拮抗藥物西咪替丁和雷尼替丁的方法，基于其化學結構，提出了含柔性連接鏈類和二元芳環或芳雜環類的組胺H2受體拮抗劑經碰撞誘導解離的裂解規律。該方法可同時完成定性篩查和定量分析，為發現、識別和檢測該類組胺受體拮抗劑提供了研究基礎，有利于對樣品中未知組胺受體拮抗劑進行篩查和確證。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1290高效液相色譜儀串聯6540四極桿/飛行時間質譜儀，配雙噴霧電噴霧離子源Dual-ESI(美國安捷倫科技公司)；AL204電子分析天平(萬分之一)、XP205電子分析天平(十萬分之一)均購于瑞士梅特勒-托利多公司；arium pro超純水系統(德國賽多利斯公司)。

西咪替丁標準品(99.8%)、鹽酸雷尼替丁標準品(99.9%)，購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈(色譜純，美國賽默飛世爾公司)；甲酸(質譜純，美國賽默飛世爾公司)。祛痘類化妝品購自網店和線下商店。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備液：分別取西咪替丁、雷尼替丁標準品約10 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，得到質量濃度約為1 mg/mL的標準儲備液，于-20 ℃保存。

混合標準溶液：將標準儲備液用甲醇稀釋，得到質量濃度為5、10、20、50、100 ng/mL的系列混合標準工作溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-Aq柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm，美國安捷倫科技公司)；柱溫為30 ℃；進樣體積為2 μL；流速為0.3 mL/min；流動相：A為含0.1%甲酸的水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序：0～6.0 min，5%～90% B；6.0～9.0 min，90% B；9.0～9.1 min，90%～5% B；9.1～12 min，5% B。

1.4 質譜條件

采集模式：正離子模式；離子源：雙噴霧電噴霧離子源(Dual-ESI源)，檢測時同時導入參比離子對儀器質量軸進行實時校正，參比離子的m/z為121.050 9和922.009 7；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L/min；毛細管電壓：3 500 V；錐孔電壓：65 V，碰撞氣：氮氣。用全掃描(Scan)模式對準分子離子[M+H]+進行確認后，進一步對其進行碰撞誘導解離(CID)，將樣品的二級質譜圖與標準品圖譜進行比對和確證。

1.5 樣品制備

取樣品約0.5 g，精密稱定，置于25 mL比色管中，加入20 mL甲醇，在渦旋振蕩儀上混勻30 s后超聲提取20 min，靜置至室溫，用甲醇定容，搖勻，提取液經0.22 μm 濾膜過濾后分析。必要時用適量甲醇對樣品進行稀釋后測定。

1.6 篩查分析方法

通過安捷倫MassHunter工作站的數據采集軟件對樣品進行全掃描，用定性分析軟件對采集的數據進行分析，同時對保留時間和精確質量數進行檢索，軟件打分80分以上認為匹配成功，作為疑似陽性樣品進行二級碎片離子掃描。若經二級碎片離子掃描確證為陽性樣品，進一步用定量分析軟件對其進行定量。

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優化

2.1.1 色譜條件的優化分別考察了BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)和Zorbax SB-Aq(3.0 mm×100 mm,1.8 μm)3種色譜柱對西咪替丁和雷尼替丁的分離效果，結果表明，目標化合物在BEH C18色譜柱上拖尾較明顯，在HSS T3和Zorbax SB-Aq色譜柱上的峰形對稱，可選擇HSS T3和Zorbax SB-Aq色譜柱或其等效色譜柱進行檢測。本實驗選擇Zorbax SB-Aq色譜柱進行分析。

實驗發現在不同時間檢測時，西咪替丁和雷尼替丁的保留時間變化較大，將同一標準品放置12 h后進行測定時，保留時間與放置前相差約1.5 min，這可能與西咪替丁和雷尼替丁對流動相的pH值變化敏感有關。考慮到西咪替丁和雷尼替丁的胺基易接受H+形成[M+H]+的準分子離子，在水相中加入適量的H+，利于有機胺類向其共軛酸轉化形成質子化形式，一方面可提高質譜分析的離子化效率，另一方面可使液相色譜的保留時間穩定。在脂肪族的一元羧酸中，甲酸的酸性最強[11]，因此考察了流動相水相中加入不同含量甲酸的分離效果，結果表明，當水相中甲酸含量為0.1%時，西咪替丁和雷尼替丁的保留時間穩定且響應良好。最終選擇含0.1%甲酸的水溶液與乙腈作為流動相。

2.1.2 質譜條件的優化定性分析：高分辨質譜通過對二級碎片離子指紋圖譜的比對進行定性，考察了碰撞能量為10～40 eV時西咪替丁和雷尼替丁的母離子及碎片離子豐度比。結果表明，當碰撞能量為10 eV時，二者的母離子被碰撞誘導解離的程度較低(相對豐度比高于80%)；當碰撞能量≥20 eV時，母離子基本完全被碰撞誘導解離(相對豐度比小于1%)，且碰撞能量為20 eV時，西咪替丁和雷尼替丁的主要碎片離子具有較高的相對豐度，可提高定性分析時子離子比對的準確性。相對豐度為西咪替丁：m/z95.060 7(100%),m/z159.069 8(73%)；雷尼替丁：m/z176.049 0(100%),m/z130.055 8(61%)。因此，選擇碰撞能量為20 eV。

定量分析：與低分辨質譜不同，高分辨質譜的定量分析可選擇用母離子或子離子[12-17]，由于母離子的響應更強，且一級全掃描具有更快的速度，因此選用母離子進行定量分析。西咪替丁的定量離子為m/z253.123 5，雷尼替丁的定量離子為m/z315.149 1。

2.2 方法學考察

2.2.1 空白實驗分別取甲醇、空白基質提取液按優化的色譜條件和質譜條件進行測定，結果表明空白基質中西咪替丁和雷尼替丁的提取色譜圖均無干擾。

2.2.2 線性范圍分別用甲醇、空白基質配制質量濃度為5、10、20、50、100 ng/mL的溶劑標準工作溶液和基質標準工作溶液，以西咪替丁、雷尼替丁的質量濃度(x，ng/mL)為橫坐標，對應峰面積(y)為縱坐標進行線性擬合。結果表明，西咪替丁和雷尼替丁分別在5.65～113 ng/mL和4.95～99.0 ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數r>0.999(見表1)。

2.2.3 檢出限與定量下限采用本方法對基質標準工作溶液進行測定，以信噪比分別為3、10時樣品的質量濃度作為方法的檢出限和定量下限。結果表明，西咪替丁的檢出限和定量下限分別為1.1、5.6 ng/mL，雷尼替丁的檢出限和定量下限分別為0.99、5.0 ng/mL。當取樣量為0.5 g時，西咪替丁的檢出濃度和定量濃度分別為0.057、0.28 μg/g，雷尼替丁的檢出濃度和定量濃度分別為0.050、0.25 μg/g。

2.2.4 基質效應質譜分析時，基質中的共提取物可能會對西咪替丁和雷尼替丁產生抑制或增強作用，影響結果的準確性。本實驗采用標準曲線測定法對基質效應進行考察，通過空白基質標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率的比值(簡稱斜率比)進行評價，若斜率比<100%，則表示基質對分析物存在抑制作用；若斜率比>100%，則表示基質對分析物存在增強作用；若斜率比=100%，則表示不存在基質效應。當斜率比為80%～120%時，表明基質干擾作用較小[18]。對液態水基、乳液、膏霜類化妝品的基質效應進行了考察，實驗結果表明，乳液、膏霜類基質對西咪替丁、雷尼替丁的測定干擾作用較小，液態水基類基質對測定具有一定程度的抑制作用(見表1)。本實驗采用基質匹配標準曲線外標法進行定量分析，以消除或降低基質效應的影響。

表1 西咪替丁與雷尼替丁的回歸方程、相關系數、線性范圍及基質效應Table 1 Regression equations,correlation coefficients,linear ranges and matrix effects for cimetidine and ranitidine

2.2.5 回收率與重復性通過標準加入法，在液態水基、膏霜、乳液空白基質中分別加入標準溶液，按樣品制備方法，對低、中、高濃度水平的待測樣品進行加標回收率考察，實驗結果采用基質匹配標準曲線外標法進行定量分析。其中，西咪替丁的加標濃度分別為11.3、56.4、90.2 ng/mL，雷尼替丁的加標濃度分別為9.90、49.5、79.2 ng/mL。結果表明，在不同基質中西咪替丁和雷尼替丁的回收率為86.7%～110%，相對標準偏差(RSD)為0.90%～6.0%。另制備6份低濃度平行樣品，測定目標化合物的含量，對方法重復性進行考察，RSD 均小于10%。低濃度樣品放置3 d，每天檢測1次，日間精密度RSD不大于8.5%(見表2)。

表2 不同基質中的回收率(n=3)、重復性(n=6)及日間精密度(n=3)Table 2 Recoveries(n=3),repeatability(n=6) and inter-day precision(n=3)of cimetidine and ranitidine spiked to different matrix samples (%)

圖1 西咪替丁和雷尼替丁的結構Fig.1 Structures of cimetidine and ranitidine

2.3 裂解規律解析

根據化學結構不同，組胺H2受體拮抗劑可分為含柔性連接鏈類和二元芳環或芳雜環類。西咪替丁和雷尼替丁均屬于含柔性連接鏈類結構[1]，結構通式為：氫鍵鍵合的極性基團—柔性鍵—芳環(見圖1)。對西咪替丁和雷尼替丁主要碎片離子(相對豐度比>50%)的精確質量數(見表3、圖2)及分子離子式進行分析，推斷西咪替丁和雷尼替丁的裂解規律。

西咪替丁的分子式為C10H16N6S，在正離子模式下獲得質子，形成C10H17N6S的準分子離子(精確質量數為253.123 0)，經碰撞誘導解離，與芳雜環連接的一側柔性鍵斷裂，形成C5H11N4S(精確質量數為159.069 9)及C5H7N2(精確質量數為95.060 4)的離子。C5H11N4S離子可在極性基團一側發生斷裂，即圖1中與X連接的鍵斷裂，脫去NCNH2后形成C4H9N2S的離子(精確質量數為117.048 1)。

雷尼替丁的分子式為C13H22N4O3S，在正離子模式下獲得質子，形成C13H23N4O3S的準分子離子(精確質量數為315.148 5)。雷尼替丁的分子式中有3個O原子，分布在柔性連接—S—的兩側，分別為芳雜環上的1個O原子和極性基團末端—NO2中的2個O原子。依據分子離子式中O原子的數量可對裂解途徑進行輔助判斷。準分子離子C13H23N4O3S被碰撞誘導解離后—S—與芳雜環連接的鍵斷裂，脫去芳雜環分子C8H13NO，形成C5H10N3O2S的離子(精確質量數為176.048 8)，該離子進一步脫去1分子NO2，形成C5H10N2S的離子(精確質量數為130.055 9)。

上述裂解途徑表明，西咪替丁及雷尼替丁的準分子離子經碰撞誘導解離后，與芳雜環連接的一側柔性鍵易發生斷裂，脫去芳雜環分子，形成—S—與極性基團連接的離子，該離子末端的含N基團隨后發生斷裂(見表3)。對裂解規律的研究有利于發現、識別和檢測該類組胺受體拮抗劑，為化妝品中含柔性連接鏈類結構的組胺H2受體拮抗劑的非靶向篩查提供依據。

表3 西咪替丁和雷尼替丁主要碎片離子的精確質量數Table 3 Exact mass numbers of main fragment ions for cimetidine and ranitidine

圖2 西咪替丁(A)和雷尼替丁(B)的二級碎片離子質譜圖Fig.2 Secondary fragment ion mass spectra of cimetidine(A) and ranitidine(B)

2.4 樣品測定

在銷售環節采購祛痘類化妝品51批，對其中的西咪替丁和雷尼替丁進行篩查和確證。經高效液相色譜-四極桿/飛行時間高分辨質譜進行全掃描，用MassHunter定性分析軟件對樣品中母離子的精確質量數及保留時間與標準品進行匹配，發現有3批樣品中西咪替丁的保留時間差在±0.2 min，母離子精確質量數誤差在20 ppm以內，疑似為西咪替丁陽性樣品。根據2002/657/EC準則[19]對于質譜方法4個識別點的規定，高分辨質譜的母離子為2個識別點，子離子為2.5個識別點，即只要找到母離子及1個子離子或找到2個子離子即可對目標化合物進行確證。因此進一步對疑似陽性樣品進行二級碎片離子全掃描，在20 eV的碰撞能量下，將陽性樣品的二級碎片指紋圖譜與標準圖譜進行比對(圖3)，在樣品中至少可找到2個西咪替丁的子離子與標準品一致，例如二者中均存在m/z95.060 4、117.047 9、159.069 6碎片離子，確證為陽性樣品。對3批陽性樣品進行定量分析，其中1批西咪替丁的含量高于檢出限，低于定量下限，另2批樣品中西咪替丁的含量分別為6.67 mg/g、10.6 mg/g。51批樣品均未檢出雷尼替丁。采用液相色譜-三重四極桿質譜對51批樣品進行定性和定量分析，結果與本方法一致。

圖3 西咪替丁陽性樣品(A)與標準品(B)的比對譜圖Fig.3 Comparison of mass spectra for cimetidine positive samples(A) and standard(B)

3 結 論

本文采用高效液相色譜-四極桿/飛行時間高分辨質譜建立了化妝品中西咪替丁及雷尼替丁的測定方法。應用高分辨質譜技術，不僅前處理方法簡單、儀器掃描速度快，且無需標準品即可完成定性篩查和確證，提高了實驗效率，節約了實驗成本。此外，本文對西咪替丁和雷尼替丁的裂解規律進行了研究，提出碰撞誘導解離的可能路線，為化妝品中抗組胺類化合物的非靶向篩查提供了研究基礎，也為化妝品安全監管提供了技術支持。