艾灸神闕穴對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血清促炎性因子及腸黏膜緊密連接蛋白的影響?

穆韻濃 趙百孝 任俊逸 王寶泉 孔佑甲 安 雨 劉雅潔 張心悅 姚 琴 和 蕊

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種發(fā)生于大腸黏膜及黏膜下層的非特異性炎癥性腸病[1]，主要臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、發(fā)熱、貧血等[2]。其病因尚未明確，可能與感染、過(guò)敏、免疫系統(tǒng)紊亂、精神焦慮及抑郁等因素有關(guān)。研究表明，腸上皮屏障功能障礙是UC主要的致病因素，緊密連接結(jié)構(gòu)是腸上皮屏障最重要的組成部分，能防止腸腔內(nèi)致病性抗原，如細(xì)菌、病毒、內(nèi)毒素等物質(zhì)進(jìn)入黏膜固有層和血液循環(huán)[3]。Occludin、ZO-1是腸上皮屏障中兩個(gè)重要的緊密連接蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞間物質(zhì)流動(dòng)、維持上皮細(xì)胞極性、阻止毒性大分子和微生物通過(guò)等功能，在維護(hù)腸道屏障功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4-5]，同時(shí)影響炎性因子的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體炎性反應(yīng)。本研究采用艾灸神闕穴法干預(yù)3.5%葡聚糖硫酸鈉造模的UC小鼠，觀察其對(duì)UC小鼠腸上皮Occludin、緊密連接蛋白1（ZO-1）的蛋白表達(dá)和促炎性因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的影響，進(jìn)而探討艾灸神闕穴治療UC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

32只健康雄性ICR小鼠，體質(zhì)量20～23 g，購(gòu)自維通利華（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SYXK（京）2016-0038。常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，12 h光照/黑夜循環(huán)，溫度20～24℃，濕度50%～60%，自由飲食飲水飼養(yǎng)。小鼠購(gòu)進(jìn)后先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑

特制細(xì)艾條（河南南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限公司，規(guī)格0.5 cm×20 cm）；DSS（美國(guó)MP Biomedicals公司，批號(hào)Q1723）；美沙拉嗪緩釋顆粒劑（上海愛(ài)的發(fā)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20143164）；便隱血試劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，規(guī)格200測(cè)試/盒）；小鼠白細(xì)胞介素6酶聯(lián)免疫試劑盒（Mouse IL-6 ELISA Kit RGB&CHN Lot：20200109.60023M）；小鼠腫瘤壞死因子α酶聯(lián)免疫試劑盒（Mouse TNF-α ELISA Kit RGB&CHN Lot：20200109.60080M）；Anti-ZO1 tight junction蛋白抗體（abcam公司，ab216880）；Anti-Occludin抗體[EPR8208]（bcam公司，ab167161）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Fresco低溫冷凍離心機(jī)（Thermo）；Multi Skan3酶標(biāo)儀（Thermo）；小鼠固定器（上海華巖儀器設(shè)備有限公司，規(guī)格 150 mm×65 mm×50 mm）；Thermo Multiskan MK3（產(chǎn)地：芬蘭）；Mini P-4電泳槽（Cavoy）；濕轉(zhuǎn)電泳槽（Cavoy）；電泳儀（Bio-Rad）；半干槽（Bio-Rad）；水平脫色搖床（其林貝爾）；酸度計(jì)pH211（Hanna）；電動(dòng)組織勻漿器（Fluka）；石蠟切片機(jī)（LEICA，RM 2235）；石蠟包埋機(jī)（LEICA，EG 1160）；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，50X）。

1.4 分組及造模

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取8只小鼠作為空白對(duì)照組，其余24只均通過(guò)自由飲用3.5%DDS溶液8 d進(jìn)行造模，造模成功后，再將24只模型小鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性藥物組和艾灸組，每組8只。

1.5 干預(yù)方法

造模完成后次日開始分組干預(yù)，持續(xù)8 d。空白對(duì)照組和模型組：將小鼠放入固定器，固定頭、尾、四肢部位，每次20 min，每日1次。陽(yáng)性藥物組：按0.4 g/kg體質(zhì)量灌胃美沙拉嗪溶液，每日1次。艾灸組：將小鼠放入固定器固定，固定頭、尾、四肢部位，將固定器架起，固定器底部設(shè)有橢圓形孔，可暴露小鼠腹部神闕穴，點(diǎn)燃艾條并放置在小鼠神闕穴位置下方，進(jìn)行艾灸。在艾灸過(guò)程中，不斷調(diào)整艾條高度，使艾灸的溫度基本保持恒定。艾灸干預(yù)每次20 min，每日1次，共8 d。

1.6 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)估

造模第1天起記錄小鼠的體質(zhì)量變化、排便情況、便隱血情況，并作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。各指標(biāo)評(píng)分方式如下。1）體質(zhì)量下降率：無(wú)下降0分；下降1%～5%記1分；下降5%～10%記2分；下降10%～15%記3分；下降率大于15%記4分。2）便質(zhì)情況：正常記0分，稀軟便記2分；水樣便記4分；3）便潛血情況：陰性記0分；陽(yáng)性記2分；肉眼血便記4分。DAI評(píng)分為3項(xiàng)評(píng)分的平均值。DAI=（體量下降評(píng)分+大便形狀評(píng)分+大便隱血情況評(píng)分）/3。

1.7 標(biāo)本采集與檢測(cè)

末次干預(yù)后，禁食不禁水12 h，測(cè)量體質(zhì)量后，用3.5%水合氯醛0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉，摘眼球取血后迅速脫椎處死，并剖開腹部，分離結(jié)腸，自恥骨聯(lián)合處至盲腸取下整段結(jié)腸，沿腸系膜縱行剖開，予生理鹽水和PBS緩沖液中輕柔漂洗后肉眼觀察結(jié)腸大體形態(tài)，自下而上將截取結(jié)腸分成兩部分，一部分固定于4%多聚甲醛固定液中，用于形態(tài)學(xué)觀察；剩余部分置于液氮1 h后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｑ獦屿o置1 h后離心，取上清液用于ELISA檢測(cè)。

1.7.1 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 結(jié)腸組織切片采用HE染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.7.2 Western blotting法檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織Occludin、ZO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平 用眼科剪剪碎組織塊，稱重研磨后以質(zhì)量∶裂解液體積=1∶9的比例加入裂解液，勻漿，離心后取上清，進(jìn)行細(xì)胞蛋白抽離，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)目的蛋白的分子量，配制12%～15%分離膠，5%濃縮膠濃度進(jìn)行SDSPAGE電泳分離，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部停止分離，于300 mA恒流和0.45 μm孔徑NC膜條件下進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜2 h，封閉于5%脫脂奶粉-TBST中60 min，用5%脫脂奶粉-TBST稀釋稀釋一抗，室溫孵育10 min，放4℃過(guò)夜，第2天拿出在室溫下孵育30 min，進(jìn)行洗膜5次，每次3 min。加入稀釋濃度1∶5 000的二抗室溫輕搖40 min，洗膜。加ECL后反應(yīng)3～5 min，曝光，顯影定影。采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的相對(duì)表達(dá)量。

1.7.3 ELISA法檢測(cè)IL-6和TNF-α 取小鼠清晰非溶血的血清樣品100 μL，采用ELISA法測(cè)定TNF-α和IL-6含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以（）表示。符合正態(tài)分布且方差齊則采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)比較，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，如若不符合正態(tài)分布或方差齊性檢驗(yàn)，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠的一般情況

空白對(duì)照組小鼠體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，反應(yīng)靈敏，眼神靈活，大便呈正常性狀，毛發(fā)亮澤。模型組小鼠在造模過(guò)程中出現(xiàn)腹瀉、便血、肛門周圍有血及污穢附著、飲食較差、體質(zhì)量減輕、毛發(fā)凌亂無(wú)光澤、精神呆滯等情況。各組開始不同干預(yù)后，艾灸組小鼠體質(zhì)量與陽(yáng)性藥物組小鼠相比增長(zhǎng)較慢，隨著治療次數(shù)的增加，小鼠便血情況逐漸減弱甚至消失，精神狀態(tài)逐漸恢復(fù)，尤其艾灸組小鼠大便形狀恢復(fù)正常速度較快，艾灸第2～3天大部分小鼠已經(jīng)由稀便轉(zhuǎn)至正常。

2.2 各組小鼠DAI評(píng)分比較

與空白對(duì)照組比較，模型小鼠第2天即出現(xiàn)便潛血陽(yáng)性，第3～4天即出現(xiàn)肉眼可見血便、稀便，同時(shí)體質(zhì)量明顯下降，食量減少，活動(dòng)度低，毛色變差；隨著飲用DSS溶液時(shí)間的延長(zhǎng)，各現(xiàn)象逐漸加重。在第8天對(duì)各組實(shí)行不同干預(yù)后，艾灸組與陽(yáng)性藥物組的體質(zhì)量下降程度、大便性狀和便血現(xiàn)象均得到改善。與空白組相比，模型組的DAI評(píng)分[（1.27±0.51）分]顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與陽(yáng)性藥物組[（1.34±0.49）分]相比，艾灸組DAI評(píng)分[（2.38±0.57）分]減少，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。可見艾灸組可以降低UC小鼠的DAI評(píng)分。

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)比較

見圖1。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組結(jié)腸黏膜上皮完整，上皮細(xì)胞連接緊密，結(jié)腸腸腺排列規(guī)整，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見明顯病變表現(xiàn)。模型組可見黏膜層缺損，上皮細(xì)胞連接松散，杯狀細(xì)胞減少，隱窩破壞，可見大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。艾灸組、陽(yáng)性藥物組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)改善明顯，黏膜缺損情況較模型組均得到明顯修復(fù)，結(jié)腸黏膜上皮較完整，細(xì)胞連接較緊密，極少隱窩破壞，基本無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞分泌增多。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)病理學(xué)觀察（HE染色，400倍）

2.4 各組小鼠結(jié)腸組織Occludin、ZO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平比較

見圖2，表1。與空白對(duì)照組相比，模型組Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比，艾灸組Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)量明顯提升（P＜0.01），與陽(yáng)性藥物組趨勢(shì)一致，提示艾灸組可提高UC小鼠腸上皮緊密連接蛋白含量，對(duì)腸上皮屏障恢復(fù)具有正向影響。

圖2 各組小鼠腸上皮ZO-1、Occludin蛋白的表達(dá)

表1 各組小鼠腸上皮ZO-1、Occludin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1 各組小鼠腸上皮ZO-1、Occludin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。下同

組別空白對(duì)照組模型組艾灸組陽(yáng)性藥物組n 6 6 6 6 ZO-1 9.48±2.64**2.82±1.51 6.77±1.82**7.08±1.88**Occludin 8.29±1.61**2.55±0.79 7.59±1.56**6.83±1.24**

2.5 各組小鼠血清IL-6和TNF-α含量比較

見表2。小鼠血清中IL-6和TNF-α水平均呈空白對(duì)照組<艾灸組<陽(yáng)性藥物組<模型組的趨勢(shì)。與空白對(duì)照組相比，模型組IL-6和TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，艾灸組及陽(yáng)性藥物組IL-6和TNF-α水平明顯降低（P＜0.05）；艾灸組和陽(yáng)性藥物組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組小鼠血清中IL-6、TNF-α含量比較（ng/L，±s）

表2 各組小鼠血清中IL-6、TNF-α含量比較（ng/L，±s）

組別空白對(duì)照組模型組艾灸組陽(yáng)性藥物組n6 6 6 6 IL-6 24.33±3.75*47.53±10.25 26.02±4.90*32.43±3.70*TNF-α 40.12±6.19*74.93±16.28 42.07±8.02*53.13±6.02*

3 討論

UC屬于炎性腸病的一種，在臨床上屬于難治疾病，近年來(lái)我國(guó)UC患者逐漸增多[6]，其發(fā)病機(jī)制與特異性病因尚不明確，可能與環(huán)境和人體免疫機(jī)制異常等諸多因素有關(guān)[7]。越來(lái)越多的文獻(xiàn)證實(shí)了UC的發(fā)生、恢復(fù)與腸黏膜屏障存在密切關(guān)系，所以促進(jìn)腸上皮屏障恢復(fù)、維持腸黏膜系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，是治療UC的重要環(huán)節(jié)[8]?，F(xiàn)階段臨床治療UC主要以柳氮磺胺吡啶水楊酸制劑和皮質(zhì)類固醇類藥物為主，但效果并不十分理想且容易對(duì)機(jī)體正常免疫機(jī)制等產(chǎn)生影響。所以，尋找一種安全、綠色的療法是當(dāng)前治療UC的需求。

艾灸具有“溫通經(jīng)脈，行氣活血，調(diào)整臟腑陰陽(yáng)平衡”的作用。艾灸法操作簡(jiǎn)便易學(xué)、綠色安全、經(jīng)濟(jì)易普及，無(wú)論是日常保健還是臨床應(yīng)用都十分廣泛。艾灸通過(guò)刺激穴位，激發(fā)經(jīng)絡(luò)，調(diào)節(jié)陰陽(yáng)，從而治療疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，臍作為胚胎發(fā)育過(guò)程中的重要部分，通過(guò)豐富的血管、神經(jīng)和淋巴管等傳輸營(yíng)養(yǎng)，出生以后閉合，且皮下無(wú)脂肪組織，緊鄰各種腹腔內(nèi)組織器官，所以可通過(guò)臍局部干預(yù)獲取臨床效果[9]，選取位于此處的神闕穴，可培補(bǔ)元?dú)?、理順腸胃。神闕又屬下焦之樞紐，鄰近胃與大小腸，有健脾養(yǎng)胃、理腸止瀉之功效。UC可能與濕熱凝滯、邪毒伏內(nèi)、脾腎陽(yáng)虛、隱血虧虛等有關(guān)，針對(duì)于此，我們以固護(hù)脾腎、行氣活血、祛濕通滯為則，采用艾灸神闕穴法，調(diào)整胃腸氣機(jī)，通行全身氣血，激發(fā)腎間動(dòng)氣和脾胃之氣，從而恢復(fù)腸黏膜組織屏障穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)UC患者康復(fù)。

腸黏膜是腸屏障的重要組成部分[10]。腸黏膜屏障分為上皮、生物、免疫、化學(xué)四部屏障，其中上皮（機(jī)械）屏障是腸黏膜屏障的首道重要防線[11-12]，腸機(jī)械屏障主要指的是腸上皮細(xì)胞以及細(xì)胞間的連接。緊密連接蛋白主要起著調(diào)節(jié)細(xì)胞的通透性，在細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境進(jìn)行信號(hào)傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、表型、極性等作用。在腸道生理中，ZOs作為免疫組織化學(xué)檢查時(shí)的標(biāo)志性蛋白，對(duì)于細(xì)胞間緊密連接的形成和屏障功能的維持具有重要作用。緊密連接結(jié)構(gòu)一旦受損，腸黏膜通透性就會(huì)增加，從而引發(fā)生炎性反應(yīng)。ZO-1對(duì)協(xié)調(diào)緊密連接復(fù)合物有著重要的作用，同時(shí)還調(diào)控著細(xì)胞旁路屏障功能和腸上皮細(xì)胞通透性[13]。它的表達(dá)分布密切影響著緊密連接的功能及結(jié)構(gòu)。Occludin蛋白作為跨膜蛋白，是緊密連接中最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，不僅能通過(guò)外環(huán)以拉鏈?zhǔn)浇Y(jié)合進(jìn)而產(chǎn)生嚴(yán)密的細(xì)胞旁封閉，還能與不同的分子結(jié)合，參與緊密連接形成的信號(hào)調(diào)節(jié)[14]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)DSS造模后的小鼠腸上皮屏障與空白對(duì)照組相比嚴(yán)重受損，出現(xiàn)明顯黏膜層缺損，上皮細(xì)胞連接松散等現(xiàn)象，ZO-1和Occludin的蛋白表達(dá)也與空白組有明顯差異。經(jīng)干預(yù)后，艾灸組的ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，病理切片觀察也有明顯改善，與陽(yáng)性藥物組趨勢(shì)一致，提示艾灸治療UC的起效機(jī)制可能與腸上皮屏障中緊密連接蛋白的表達(dá)有關(guān)。

在免疫屏障中，與UC關(guān)系密切的促炎因子主要有IL-1、IL-6、TNF-α等，這些炎性因子的表達(dá)與UC發(fā)病過(guò)程中病理組織行程及炎性反應(yīng)有很大關(guān)系[15]。文獻(xiàn)表明，TNF-α是UC發(fā)病機(jī)制中的啟動(dòng)因子之一，在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，通過(guò)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的聚集，對(duì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生刺激進(jìn)而發(fā)生炎癥反應(yīng)[16]。在正常情況下，TNF-α可抗感染、抗腫瘤，若釋放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或釋放量過(guò)多則可產(chǎn)生疾病反應(yīng)。IL-6是一種作用廣泛的促炎性因子，可促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞的活化、增生及毒性反應(yīng)[17]。TNF-α可誘導(dǎo)IL-6生產(chǎn)，而過(guò)高的IL-6表達(dá)可刺激淋巴B細(xì)胞合成自身抗體，增強(qiáng)TNF-α的表達(dá)，從而加重炎性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠血清中的TNF-α和IL-6明顯增加，高于空白組，證明模型組小鼠炎性反應(yīng)較大，而經(jīng)過(guò)艾灸神闕穴處理后，兩種炎性因子的表達(dá)均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，趨勢(shì)與陽(yáng)性藥物組一致，提示艾灸對(duì)UC的治療也在免疫機(jī)制中有效。

一系列研究發(fā)現(xiàn)UC患者血清中IL-6和TNF-α濃度明顯升高，且與病變范圍和病變嚴(yán)重程度成正相關(guān)。如果腸上皮屏障系統(tǒng)受到損害或構(gòu)成緊密連接的蛋白表達(dá)異常，則會(huì)導(dǎo)致ZO-1和Occludin表達(dá)量下降，腸上皮細(xì)胞通透性增加，內(nèi)毒素、細(xì)菌及大分子物質(zhì)會(huì)通過(guò)腸上皮進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，引起并加重UC[14]。因此，腸黏膜各屏障協(xié)同作用，共同保護(hù)腸黏膜，本文從免疫屏障和上皮屏障共同論述，觀察IL-6和TNF-α、緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)情況，作為治療的切入點(diǎn)和靶點(diǎn)，對(duì)UC治療是十分重要的。

越來(lái)越多的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，艾灸在UC的治療和康復(fù)上有明顯療效，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡、改善腸道黏膜病變、控制腸道炎癥中起重要作用[18]。艾灸能下調(diào)腸黏膜炎性因子IL-6/TNF-α的表達(dá)和升高上皮屏障ZO-1和Occludin的蛋白表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)，恢復(fù)腸道屏障，本研究結(jié)果可為UC的防治提供一定的研究依據(jù)。