糖脂代謝紊亂大鼠模型腸道菌群結構變化

魏曉藝 車念聰 張哲滔 田 甜 彭思揚 劉 柯 鄭亞琳

現代常見的高糖高脂飲食習慣是導致或加重糖脂代謝異常情況的重要因素。與糖脂代謝異常相關的疾病發生率也逐漸提升，其中，糖尿病是全球性的公共衛生問題之一。經濟快速增長，飲食結構西化，人口流動性變化，使得中國的糖尿病發生率大幅上升。與2001年全國性調查報道的5.5%的發生率比較， 2010年這一比例已經上升到11.6%。基于此的預測表明，中國擁有世界上最多的糖尿病患者。一項前瞻性研究認為，肥胖、高血壓和血脂異常與2型糖尿病的風險直接相關[1～3]。人體腸道中寄居著大量厭氧和需氧細菌群體，可以通過能量代謝、免疫調節和炎癥機制等多種途徑影響肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等多種代謝性疾病的發生、發展。腸道細菌數量可達到100萬億，占有量較大的為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門等[4，5]。本研究采用Illumina Miseq高通量測序技術，對正常組和鏈脲佐菌素(STZ)聯合高糖高脂飲食誘導的糖脂代謝紊亂大鼠腸道菌群結構改變的特征進行了初步分析，旨在探索腸道菌群與血糖、血脂的關系，為通過調節腸道菌群來改善血糖、血脂代謝提供實驗基礎。

材料與方法

1.動物及模型制備:本實驗動物倫理經首都醫科大學動物倫理學委員會審核通過(倫理編號:AEEI-2017-019)。造模方法延續課題組的前期研究[6]。SPF級雄性SD大鼠16只，體質量180～200g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養在首都醫科大學實驗動物部SPF級動物房。室溫保持在22±2℃，相對濕度為26%±2%，按正常晝夜節律調節光照時間。在使用普通飼料進行適應性飼養2周后，采用隨機數字表，將動物分為正常組(Z組)和模型組(M組)，每組8只。正常組動物予以普通飼料，模型組動物飼以高糖高脂飼料(基礎飼料58.8%，豬油10%，蔗糖20%，膽鹽0.2%，蛋黃粉10%，膽固醇1%)。飼養4周后，所有大鼠禁食12h，模型組大鼠經腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液配制的1%鏈脲佐菌素(STZ)，劑量為35mg/kg；正常組大鼠經腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。注射1周后經尾尖采血檢測造模組大鼠空腹血糖，以空腹血糖>16.7mmol/L為造模成功。模型組大鼠以高糖高脂飼料繼續喂養，每周定時測空腹血糖、體質量。首次注射STZ后對模型組大鼠血糖進行檢測，有1只大鼠空腹血糖不達標，以同樣方法補注，1周后復測血糖仍<16.6mmol/L，故淘汰；正常組大鼠死亡1只，故實驗結束時，正常組存活大鼠7只，模型組7只。飼養全過程中動物自由飲食飲水。第14周末，動物隔夜禁食12h，次日先經尾靜脈采血檢測大鼠空腹血糖及體質量，后經腹主動脈取血，靜置約2h后3000r/min離心15min，取血清凍存于-20℃冰箱備用；剖腹，取盲腸內容物于無菌凍存管中，快速放入-80℃冰箱中保存。

2.血生化指標的測定:采用日本奧林巴斯株式會社全自動生化儀AU480檢測各組大鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量；羅氏血糖儀(活力型)檢測大鼠空腹血糖(GLU)；放免法檢測血清胰島素(INS)；穩態模型評價胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，即空腹血清胰島素×空腹血糖/22.5，以評價胰島素抵抗(IR)水平。

3.腸道菌群結構的檢測:稱取150～200mg糞便，首先抽提細菌總DNA，后對其DNA純度進行測定。將樣本在冰上融化后，充分混勻并離心，取適量樣本，采用NanoDrop2000超微量分光光度計測定其DNA純度和濃度；采用瓊脂糖凝膠電泳技術檢測DNA完整性。隨后將樣本保存至-80℃冰箱，純度合格可進行腸內容物微生態檢測。對 OTU 豐度矩陣中每個樣本的序列總數在不同深度下隨機抽樣，以每個深度下抽取到的序列數及其對應的 OTU 數繪制稀疏曲線。得到 OTU 稀疏曲線，如圖1稀釋曲線所示，在隨機抽取的序列總數達到15000以后趨于平緩。測序深度達標，可進行后續多樣評估。在檢測樣本中微生物DNA序列后，根據數據庫進行劃分，每個OTU的代表序列用于分類地位鑒定以及系統發育學分析。根據OTU在不同樣本中的豐度分布，評估每個樣本的多樣性水平。最后，對各樣本(各組之間)在不同分類水平的具體組成進行分析。

圖1 稀釋曲線

結 果

1.大鼠體質量情況:模型組大鼠在注射STZ后體質量迅速減輕，且后續增重較慢，最終體質量明顯低于正常大鼠。與正常組比較，模型組大鼠反應遲緩，毛色黃暗成縷，糞便稀軟。體質量情況如表1所示。

表1 大鼠體質量情況

與正常組比較，*P<0.05

2.血脂與糖代謝情況：模型組大鼠LDL-C和INS高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組的TC、TG、GLU和HOMA-IR與正常組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；兩組間HDL-C水平比較，差異無統計學意義，詳見表2。

表2 血脂與糖代謝情況

與正常組比較，*P<0.05,**P<0.01

3.腸道菌群整體結構:正常組、模型組共檢測出1317個OTU，其中共有OTU 507個，僅占38.5%，兩組間豐度差異較大(圖2A)，正常組獨占的OTU有241個，為不受糖脂代謝紊亂因素影響存在的；模型組獨占的OTU為62個，為受糖脂代謝紊亂影響產生的。如圖2B所示，正常組與模型組的點總體分布較為分散。

圖2 腸道菌群整體結構圖A.維恩圖；B.PCA圖，百分比表示主成分對樣本組成差異的貢獻值。橫、縱坐標軸的刻度是相對距離，無實際意義

4.腸道菌群Alpha多樣性:在進行微生物群落豐富度和多樣性分析時，常用Sobs、Chao、ace指數來描述群落物種的豐富度，用Shannon、Simpson指數來反映物種的多樣性。與前述其他4個指數不同，Simpson指數的值與其所反映的指標呈負相關。如表3所示，模型組的Sobs、Chao、ace、Shannon指數均顯著低于正常組(P<0.01)；與模型組比較，正常組的Simpson指數較低(P<0.01)。

表3 腸道菌群微生物Alpha多樣性系數表

與正常組比較，*P<0.01

圖3 群落組成柱形圖(門)

5.腸道菌群物種注釋及差異分析：在門這一級別檢測出的主要種類，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、無壁菌門(Tenericutes)豐度依次遞減(圖3)。其中放線菌門在模型組中比例升高，差異有統計學意義(P<0.01)，詳見表4。在門這一級別檢測出5類細菌在兩組間比較差異有統計學意義，其中正常組的藍藻菌門、Saccharibacteria菌門顯著高于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)；放線菌門、螺旋體(Spirochaetae)和某無分類細菌(unclassified_k_norank)在模型組中的比例明顯高于正常組(P<0.05，圖4)。在綱這一級別中，梭菌綱(Clostridia)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、芽胞桿菌綱(Bacilli)、丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)、Negativicutes鋼、疣微菌綱(Verrucomicrobiae)和放線菌綱為豐度較高的菌屬。其中梭菌綱(屬厚壁菌門)在正常組大鼠的腸道菌群中比例大于模型組；放線菌綱(屬放線菌門)在模型組大鼠腸道菌群中比例更高，二者比較差異均有統計學意義(P<0.05，圖5)。在所有菌目中，檢出差異有統計學意義的為梭菌目(Clostridiales)和紅蝽菌目(Coriobacteriales)(屬放線菌門)在模型組大鼠菌群中比例更低(P<0.05)，雙歧桿菌(Bifidobacteriales，屬放線菌門)在模型組大鼠菌群中比例更高(P<0.05，圖6)。

表4 兩組大鼠主要腸道菌群差異的比較

與正常組比較，*P<0.01

圖4 正常組與模型組大鼠腸道菌群差異分析(門)圓點顏色顯示為物種豐度占比較大的分組顏色，圓點上的Ⅰ型區間為差值的上下限值；與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖5 正常組與模型組大鼠腸道菌群差異分析(綱)與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖6 正常組與模型組大鼠腸道菌群差異分析(目)與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01

采用LefSe多級物種差異判斷分析，比較正常組大鼠和模型組大鼠腸道菌群豐度在各級分類水平下的差異，如圖7所示，圓圈由內向外依次為門、綱、目。由此可見此模型可引起7個分類水平的微生物群的上調，其中4個與放線菌門相關；另外造成梭菌門等20個分類水平微生物群的降低。

圖7 基于分類等級樹的組間差異分類單元展示圖圓圈由內向外依次為門、綱、目。淡黃色節點表示在組間無顯著差異； 紅色節點表示在該水平上下調的微生物類群；藍色節點表示在該水平上上調的微生物類群

6.糖脂代謝指標與菌群的相關性分析：當模型組TG異常時，脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、變形菌門、Saccharibacteria菌門比例改變(P<0.05)，與TG的變化呈負相關；當TC異常時，脫鐵桿菌門含量改變(P<0.05),Saccharibacteria、藍藻菌門(Cyanobacteria)發生顯著變化(P<0.01)；HOMA-IR的變化與放線菌門的比例呈正相關，與Saccharibacteria、藍藻菌門和柔膜菌門(Tenericutes)的比例呈負相關(圖8)。

圖8 TG、TC、HOMA-IR與腸道菌群(門)相關性熱圖紅色方框代表某微生物類群與環境呈正相關；藍色方框代表某微生物類群與環境呈負相關；*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

討 論

糖脂代謝紊亂常見于糖尿病、非酒精性脂肪性肝病、肥胖等疾病。對于這一病理狀態而言，分析腸道菌群的結構以及找到某類特殊菌種，可以為揭示其發生原因提供支持。本實驗延續課題組前期基礎，采用小劑量(35mg/kg)注射STZ的造模方法，破壞胰島β細胞，早期造成胰島素分泌不足，大鼠血糖逐漸升高[7]。在高糖高脂飼料喂養下，大鼠血糖持續保持高水平，使得胰島β細胞代償性分泌大量胰島素，表現為高胰島素血癥狀態；因胰島β細胞的增殖性在出生后急劇下降，且再生性低，同時飼以高糖高脂飼料，血糖調節失代償，大鼠始終處于高血糖狀態[8]。持續的高血糖、高血脂和高胰島素血癥導致胰島素抵抗，表現為糖脂能量利用和儲存紊亂的狀態[9]。有研究者研究腸道菌群發現，低微生物豐度者患代謝性疾病的風險更高[10]。另有研究者通過調查肥胖與正常人群的腸道菌群后認為，低微生物豐度組的人群常伴有高胰島素癥、體脂增高、高甘油三酯血癥，提示這類人群罹患糖尿病、非酒精性脂肪性肝病等代謝性疾病的風險增高[11]。本實驗通過16S高通量技術分別對兩組大鼠腸道菌群進行測序，結果發現模型組大鼠的腸道菌群結構發生了顯著的變化。通過對OTU的比較，筆者觀察到模型組大鼠的腸道菌群多樣性較正常組顯著降低，與一些非酒精性脂肪肝、2型糖尿病、肥胖等代謝疾病模型的菌群特征表現相合，而菌群結構改變和糖脂代謝紊亂的因果關系，還有待于進一步研究[12～14]。

另外，許多研究發現一種厚壁菌門代謝產物丁酸鹽具有抗炎、改善胰島素抵抗的作用，高糖高脂飲食導致厚壁菌的減少，可能與肥胖、IR及糖尿病的發生有關[15，16]。本實驗系統發育學的結果提示，模型組厚壁菌門的比例較正常組略低，模型組胰島素抵抗程度較正常組的增高可能與厚壁菌的減少有關。進一步在綱的水平上探究其的變化，結果顯示厚壁菌門級別上的差異主要由梭菌綱(Clostridia)導致。在既往研究中，Jia等發現非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠梭菌的相對豐度與空腹血糖呈負相關，并推測機制為丁酸梭菌CB0313.1通過參與2型免疫，調節T細胞而形成富集梭菌的環境，從而延緩和(或)抑制NOD 小鼠1型糖尿病的發生[17]。一項針對345例中國T2DM患者腸道菌群的研究顯示，糖尿病患者腸道菌群中一些產生丁酸鹽的厚壁、梭菌等豐度降低，厚壁菌門和梭菌綱的比例顯著減少[18]。本次研究顯示，與正常組比較，模型組的梭菌綱豐度顯著降低，說明梭菌可能是糖尿病發展中的一類標志細菌，與糖尿病的發生及糖脂代謝紊亂相關。另外，一些梭菌被證實與維持腸黏膜穩態有關，腸黏膜通透性的改變也與糖脂代謝紊亂有關[19，20]。關于梭菌的其他作用以及影響糖脂代謝的機制有待進一步研究。

有研究者針對2型糖尿病、胰島素抵抗、肥胖等開展的研究發現，患病組腸道菌群結構表現為高厚壁菌低擬桿菌的狀態。而Zhou等[21]和Larsen等[22]的研究發現，模型組腸道菌群出現了厚壁菌門比例低、擬桿菌門比例高的情況。在本次小樣本的研究數據中發現，模型組擬桿菌比例較正常組也有上升趨勢，二者的所占比例可能與糖脂代謝存在相關性，后續可進行大樣本量數據研究，以明確其與糖脂代謝紊亂的具體關系。除厚壁菌、擬桿菌外，放線菌也是人體腸道菌群內的優勢菌種。在醫藥、農業、生物技術中，放線菌是酶抑制劑的重要新來源，對控制糖尿病、肥胖癥、高脂血癥等碳水化合物依賴性疾病也有較高價值。然而目前鮮有放線菌和糖脂代謝互作機制的報道。本實驗中筆者發現模型組放線菌門的比例顯著增加，而同樣屬于放線菌綱的紅椿菌和雙歧桿菌在模型組中的比例相反，這可能表明不同的放線菌群之間存在拮抗關系；另外放線菌門與HOMA-IR的相關性較大，說明在高糖高脂飲食聯合STZ誘導的糖脂代謝紊亂模型中放線菌可能是潛在的標志性菌，可能會為從菌群方面調控糖脂代謝紊亂狀態的研究提供一定的參考。