基于鈣敏感受體探討花旗澤仁改善胰島素抵抗的作用機制

王 博 黃啟晶 李佳欣 陳思琦 呂忠民 孫麗英 葛鵬玲

糖尿病(diabetesmellitus，DM)是一類常見的由多種病因引發的內分泌代謝性疾病，目前世界上有4.25億人患有糖尿病，預計2045年世界上將有6.29億人罹患糖尿病[1～3]。其中2型糖尿病發生率及致死率逐年升高，已被我國列入嚴重危害人民健康的重大多發病和常見病之一[4]。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指機體靶器官或組織對胰島素生物效應的敏感度降低或喪失，是2型糖尿病發病的主要機制之一。

研究表明，PI3K/AKT通路中蛋白激酶B(AKT)活性降低是發生IR的病理基礎[5]。AKT活性可被NPS2390(鈣敏感受體拮抗劑)抑制，而GdCl3(鈣敏感受激動劑)能增強AKT活性[6]。因此，推測CaSR可能通過激活或抑制AKT的活性，進而調節PI3K/AKT信號通路的轉導，從而影響IR。本課題組前期實驗結果表明，肝臟、肌肉、脂肪及胰腺組織中均有CaSR的表達，各組織中發生IR時，AKT磷酸化位點Ser473和Thr308表達量降低，且CaSR基因及蛋白表達量均降低[7]。

目前西藥治療IR易產生治療矛盾，療效不理想，而中藥重視整體調節及辨證論治，且中藥治療具有多渠道、多靶點、毒性不良反應小等特點。本實驗所用的花旗澤仁是臨床治療脾虛濕盛、濕熱內蘊型糖尿病胰島素抵抗及相關疾病的經驗方，療效確切[8]。本課題組前期實驗結果顯示，給予花旗澤仁后肝臟、肌肉、脂肪及胰腺組織中CaSR基因、蛋白及AKT表達量均顯著上調。

本研究根據前期體內實驗證實CaSR與IR具有相關性的基礎上，將進一步在細胞水平上從CaSR角度，通過PI3K/AKT信號通路，探究花旗澤仁改善IR的作用機制，為花旗澤仁在臨床的應用及推廣奠定基礎。

材料與方法

1.實驗材料：L6肌細胞株購自ATCC(American Type Culture Collection)；健康SD大鼠20只，雌雄各半，體質量200±20g，購自黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(黑)2013-004。分籠飼養，房間溫度為20±2℃，相對濕度為50%左右，自由攝食、飲水，適應喂養1周。

2.藥物、試劑與儀器：DMEM，胎牛血清由美國Gibco公司提供；TNF-α由美國Peprotech公司提供；考馬斯亮藍由美國Sigma公司提供；DMSO由美國Sigma公司提供；Trizol Reagen由美國Invitrogen公司提供；DEPC焦炭酸二乙酯由美國Amresco公司提供；AccuPower RocketScript RT PreMix、AccuPower GreenStar qPCR PreMix由韓國Bioneer公司提供；無水乙醇、氯仿、異丙醇、甲醇、吐溫20由天津市致遠化學試劑有限公司提供；丙烯酰胺由上海埃彼化學試劑有限公司提供；Tris-HCl(pH 6.8)以及Tris-HCl(pH 8.8)由美國Amresco公司提供；RNase-free water (去離子水加入0.01%的DEPC)、10%十二烷基硫酸鈉(SDS)、DAPI、ECL化學發光試劑盒由中國Solarbio公司提供；N,N,N′,N′-四甲基二乙胺(TEMED)由美國Sigma公司提供；10%過硫酸銨(AP)由濟寧佰一化工有限公司提供；蛋白裂解液，4×蛋白上樣緩沖液由上海碧云天生物技術有限公司提供；蛋白預染marker由美國Thermo公司提供；CaSR抗體、β-actin由英國Abcam公司提供；Akt抗體由美國Cell Signaling公司提供；pAkt(s473)抗體、pAkt(T308)抗體由美國Cell Signaling公司提供；FITC標記IgG由中杉金橋公司提供；封閉液(5%脫脂奶粉)由內蒙古伊利實業集團股份有限公司提供。梯度單頭PCR儀Bio-RadS1000、real-time PCR儀 Bio-Rad CFX96、電泳儀、Universal Hood Ⅱ型Bio-RAD凝膠成像系統、半干轉膜儀由美國伯樂公司提供；生物安全柜ESCO class Ⅱ type B2由新加坡藝恩高科技有限公司提供；微量臺式低溫離心機Mircro 17R、離心機由美國Thermo公司提供；紫外分光光度計由島津有限公司提供；熒光顯微鏡、倒置顯微鏡由日本奧林巴斯公司提供；搖床由海門市其林貝爾公司提供；酶標儀由美國MD公司提供。

3.分組及模型制備：(1)正常對照組(L6肌細胞的體外培養、傳代與誘導分化)：L6肌細胞用含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素的DMEM高糖培養基在37℃、5%CO2培養箱中培養，形成單層貼壁細胞，每隔2天傳代1次。將細胞培養瓶中的培養液倒掉，PBS沖洗2次；加入1ml消化液，輕輕晃動，放入37℃、5% CO2培養箱中2min；取出培養瓶，加入4ml培養基，終止消化，將全部細胞吹下來，使細胞脫離培養瓶底部；將細胞懸液放入15ml離心管中，離心5min；離心后，移除上層廢液，向離心管紅加入培養基，將細胞吹散；沿瓶壁按1∶3比例稀釋加入細胞培養瓶中。當L6肌細胞聚合為60%～80%時，更換為含2%胎牛血清及青霉素、鏈霉素的DMEM高糖培養液在37℃、5% CO2培養箱中培養，每隔2天換1次液，6～7天后觀察L6肌細胞的肌管生長情況。(2)模型對照組[腫瘤壞死因子(TNF-α)誘導L6肌細胞產生IR]：將培養板中分化出肌管的肌肉細胞，TNF-α誘導組為6個樣本，TNF-α誘導組每孔加入2ml已配制好的TNF-α溶液(10ng/ml)。(3)花旗澤仁組：根據本課題組前期最佳藥量配比實驗，得出中藥復方花旗澤仁的最佳配比[8]。熬制前，將西洋參、澤瀉和薏苡仁三味中藥浸泡12h，加入適量的水煎煮，共煎煮3次，第1次水沸后小火煎煮60min，第2次水沸后繼續用小火煎煮45min，第3次水沸后小火煎煮30min，合并3次水煎液，過濾，水浴濃縮，含生藥量約為0.54g/ml，4℃保存。含藥血清制備：取正常SD大鼠10只，花旗澤仁組按1ml / 100g灌胃花旗澤仁水煎液，連續給藥7天。根據本課題組前期對花旗澤仁主要活性成分在大鼠血漿中藥代動力學的研究，得出在末次給藥后1h，血藥濃度達到峰值，因此，在末次給藥后1h，按3.5ml/kg腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后無菌條件下經腹主動脈采血，室溫下將血液靜置30min，待凝血堅固，血清析出，4℃ 3000r/min離心15min，再靜置15min后取上清液，同組混勻，56℃滅活30min，經0.22μm濾膜過濾除菌分裝，-80℃保存備用。臨用前將血清用DMEM培養基稀釋成10%的含藥血清溶液。(4)陽性對照組：取羅格列酮4.735mg溶于1ml DMSO中配制成10mmol/L溶液凍存備用，使用時終濃度為10-5mol/L。(5)細胞骨架考馬斯亮藍染色鑒定：在培養板上將已爬好的玻片用PBS浸洗3次，用2.5%戊二醛固定30min，PBS浸洗3次，每次3min，用1%Triton-100(PBS配制)室溫通透10min，蒸餾水漂洗3次，加入0.2%考馬斯亮藍R-250染色30min，蒸餾水清洗3次，用濾紙吸干水滴，并于顯微鏡下觀察。

4.葡萄糖氧化酶法測培養基中葡萄糖濃度將葡萄糖工作試劑加入100ml ddH2O中，振蕩混勻；96孔板中每孔取8μl培養液，加入含1ml工作試劑的試管中，振蕩混勻，另取標準液8μl，加入含1ml 工作試劑的試管中；37℃水浴20min；每試管取100μl混合液，加入96孔酶標板中；酶標儀在510nm 處測吸光光度值(A值)；根據公式計算待測液葡萄糖濃度。待測葡萄糖濃度(mmol/L) =待測液A值/標準液A值×5.5mmol/L。

5.免疫熒光法檢測CaSR在L6細胞上的定位：在培養板上將已爬好的玻片用PBS浸洗；用4%多聚甲醛固定爬片；用0.5% Triton-100(PBS配制)室溫通透20min；PBS浸洗玻片，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min，每張玻片滴加足量稀釋好的一抗放入濕盒中，4℃孵育過夜；第2天，PBST浸洗爬片，滴加稀釋好的二抗，濕盒中孵育1h，PBST浸洗玻片，滴加DAPI避光孵育5min，對細胞進行染核，PBST浸洗，盡量洗去多余DAPI；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

6.實時熒光定量PCR檢測L6細胞上CaSR mRNA的表達：(1)RNA提取的實驗方法：96孔板細胞長至90%以上，棄去培養液，PBS清洗3次后，每孔加入Trizol 1ml，搖勻，靜置消化3～5min；將各孔內消化好的細胞吸入DEPC水處理過的1.5ml EP管中，加入氯仿0.2ml，輕搖15s；室溫靜置2～3min，4℃，12000r/min離心15min后取上清無色水相(約0.5ml)移到新EP管中，加0.5ml異丙醇，室溫下靜置10min；4℃，12000r/min離心10min，觀察到到管底有白色沉淀即為總RNA，棄去上清，以75%乙醇洗滌EP管后，4℃，7500r/min離心5min；棄上清，將帶有沉淀物的離心管倒扣于濾紙上，干燥10min；用15～20μl DEPC水溶解后，56℃助溶10min，-20℃低溫保存。(2)qRT-PCR實驗：在配套的PCR反應管中加入1.0μl dT20、1.0μl 樣本RNA、18.0μl DEPC；將上述溶液混合并按條件進行反轉錄反應；以反轉錄所得cDNA為模板進行PCR擴增，具體試驗操作流程依據相關試劑盒操作說明，CaSR引物序列(正向引物序列：5′-TTCTTTGAACCTGGACGACGAGT-3′，反向引物序列：3′-GCGAGGAAGGATTTGTAC-5′)。PCR反應條件：95℃ 10min、95℃ 10s、47℃ 30s，共40個循環。按照2-△△Ct相對定量法分析目的基因與內參基因的相對表達水平。

7.蛋白印跡法檢測L6細胞上CaSR蛋白表達量及Akt活性：(1)CaSR蛋白提取：傾倒培養液，每瓶細胞加入3ml 4℃預冷的PBS，洗滌細胞3次；洗滌后將培養瓶置于冰上，每瓶細胞加入100μl的細胞裂解液(1ml RIPA+10μl PMSF+10μl蛋白酶抑制劑+10μl磷酸酶抑制劑)，于冰上裂解30min，來回搖動使細胞充分裂解；裂解完后，用移液槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中(整個過程盡量在冰上進行)；4℃ 12000r/min離心15min；將離心后的上清分裝，-80℃保存。(2)免疫印跡實驗：用微量進樣器加入裂解后的細胞樣品，80V電壓開始電泳；電泳結束后，取出凝膠放入轉膜液中，按照膜面積的1.5倍作為電流，恒流轉膜；轉膜結束后，將PVDF膜取出，放入裝有適量的5%牛奶封閉液的平皿中，37℃平緩搖動1h；將一抗用TBST稀釋比例為1∶1000，將PVDF膜放入一抗中4℃過夜；將二抗用TBST稀釋比例為1∶5000，將PVDF膜放入二抗中37℃，孵育1h；將ECL化學發光試劑滴加到PVDF膜正面上，反應2～3min后置于凝膠成像系統中曝光。

結 果

1.細胞骨架考馬斯亮藍染色鑒定結果：誘導分化前L6細胞相互交織，以梭形為主，也可見不規則三角形、多角形等，立體感差，其形狀與成纖維母細胞相似，未見肌性結構出現；顯微鏡下觀察可見，誘導分化后，L6細胞成長梭形，體力感強，細胞體積變小、排練緊密，多個細胞可融合成一條長的肌纖維(圖1A)，考馬斯亮藍染色后長的肌纖維可見多個細胞核(圖1B)，說明此時可用于建立IR模型實驗。

圖1 誘導分化后L6細胞形態(考馬斯亮藍染色，×100)

2.花旗澤仁對胰島素抵抗L6肌細胞模型葡萄糖消耗量的影響：在L6肌細胞中，與正常對照組比較，模型對照組葡萄糖消耗量明顯下降(P<0.01)，說明胰島素抵抗L6細胞模型被成功建立。與模型對照組比較，花旗澤仁組和陽性對照組葡萄糖消耗量均明顯升高(P<0.05)，詳見表1。

表1 TNF-α對L6細胞葡萄糖消耗量的影響

與正常對照組比較，*P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05；RG.葡萄糖剩余量;CG.葡萄糖消耗量

3.鈣敏感受體免疫熒光檢測結果：在L6肌細胞正常對照組、模型對照組和花旗澤仁組中均發現CaSR的表達，與正常對照組比較，CaSR在模型對照組中的分布較稀疏；與模型對照組比較，花旗澤仁組CaSR的分布較密集，詳見圖2。

圖2 各組鈣敏感受體分布圖(免疫熒光染色，×50)A.正常對照組細胞核染色；B.正常對照組受體染色；C.模型對照組細胞核染色； D.模型對照組受體染色； E.花旗澤仁組細胞核染色；F.花旗澤仁組受體染色

4.花旗澤仁對胰島素抵抗L6肌細胞中CaSR mRNA及CaSR蛋白表達水平的影響：在L6肌細胞中，與正常對照組比較，模型對照組CaSR mRNA表達水平下調(P=0.000)；與模型對照組比較，花旗澤仁組和陽性對照組CaSR mRNA表達水平顯著上調(P<0.01，表2、圖3)。CaSR蛋白表達的影響：與正常對照組比較，模型對照組中L6肌細胞CaSR蛋白表達顯著下降(P=0.000)；與模型對照組比較，花旗澤仁組、陽性對照組中L6肌細胞CaSR蛋白表達水平明顯升高(P均為0.000)，詳見表2、圖4。

表2 花旗澤仁對胰島素抵抗L6肌細胞中CaSR mRNA及CaSR蛋白表達水平的影響

與正常對照組比較,*P=0.000；與模型對照組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P=0.000

圖3 花旗澤仁對L6肌細胞中CaSR mRNA表達水平的影響與正常對照組比較，*P=0.000;與模型對照組比較，#P<0.01

圖4 花旗澤仁對L6肌細胞CaSR 蛋白表達水平的影響A.Western blot法檢測結果；B.蛋白灰度值。與正常對照組比較，*P=0.000;與模型對照組比較，#P<0.05,##P=0.000

5.花旗澤仁對胰島素抵抗L6肌細胞蛋白激酶B(AKT)活性的影響：與正常對照組比較，模型對照組L6肌細胞中磷酸化AKT(Thr308和Ser473)蛋白含量顯著下降(P均為0.000)；與模型對照組比較，花旗澤仁組L6肌細胞磷酸化AKT(Thr308 和Ser473)蛋白表達水平明顯升高(P均為0.000)；陽性對照組L6肌細胞磷酸化AKT(Thr308)蛋白表達水平明顯升高(P=0.000)，AKT(Ser473)蛋白表達差異無統計學意義,詳見表3、圖5。

6.采用免疫印跡法觀察CaSR激動劑對IR細胞模型AKT活性的影響：如表4、圖6所示，與正常對照組比較，模型對照組L6肌細胞中磷酸化AKT(Thr308和Ser473)蛋白含量顯著下降(P<0.01)；與模型對照組比較，激動劑對照組L6肌細胞磷酸化AKT(Thr308 和Ser473)蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)。

表3 花旗澤仁對L6肌細胞中Thr308和Ser473蛋白磷酸化水平的影響

與正常對照組比較,*P=0.000；與模型對照組比較,#P<0.05,##P=0.000

圖5 花旗澤仁對L6肌細胞磷酸化Akt蛋白表達水平的影響A.Western blot法檢測結果；B.蛋白灰度值。與正常對照組比較，*P=0.000;與模型對照組比較，#P<0.005，##P=0.000

表4 鈣敏感受體激動劑對L6肌細胞中Thr308和Ser473蛋白的影響

與正常對照組比較,*P<0.01；與模型對照組比較,#P<0.01

圖6 花旗澤仁及CaSR激動劑對L6肌細胞磷酸化Akt蛋白表達水平的影響A.Western blot法檢測結果；B.蛋白灰度值。與正常對照組比較，*P<0.01;與模型對照組比較，#P<0.01

討 論

隨著人們生活水平的日益提高，糖尿病，特別是2型糖尿病胰島素抵抗(insulin resistance，IR)的發生率呈現迅猛增長趨勢[2]。IR貫穿2型糖尿病主要發病過程。目前普遍認為，肝臟、脂肪、骨骼肌及胰腺組織是發生IR的重要靶組織[9]。本課題組前期研究已顯示花旗澤仁改善IR大鼠肝臟、脂肪、骨骼肌及胰腺組織的相關機制，而本實驗采用L6肌細胞為實驗研究對象，從細胞水平上進一步探究花旗澤仁改善IR的分子機制。

骨骼肌是全身利用葡萄糖最重要的組織之一，胰島素刺激的葡萄糖利用中約有80%由骨骼肌攝取[10]。在肌細胞內，胰島素抗性降低了葡萄糖的吸收。當發展成全身IR時，骨骼肌對葡萄糖的攝取能力下降可能最終導致 2 型糖尿病的發生[11]。骨骼肌細胞攝取葡萄糖主要通過胞內區室GLUT4與細胞質膜和橫小管來完成[12]。本實驗采用的大鼠L6肌細胞能反映出關于IR的生理病理狀態，是研究IR機制很好的體外細胞模型。因此，建立骨骼肌細胞的IR模型對研究IR機制及IR的防治有著重要意義。

鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)是G蛋白偶聯受體的C家族成員，是一種整合膜蛋白[13]。本研究中，采用免疫熒光技術檢測到在L6肌細胞中有CaSR存在，并且可觀察到模型對照組L6肌細胞中的CaSR數量明顯低于正常對照組，通過qRT-PCR實驗檢測到CaSR mRNA的表達，發現發生IR時，在L6肌細胞中CaSR mRNA表達量成下降趨勢。并通過免疫蛋白印跡(Western blot)法實驗，觀察到L6肌細胞中模型對照組中CaSR蛋白表達水平亦顯著下調。

蛋白激酶B(AKT)，是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在多種細胞過程中起著關鍵作用。AKT 通過結合并調節許多下游效應物(例如核因子-κB，Bcl-2家族蛋白)調節細胞存活和代謝[14]。Akt2是胰島素誘導的葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)向質膜轉運所必需的。糖原合酶激酶3(GSK3)可被AKT磷酸化后抑制，導致糖原合成增加。GSK3也參與Wnt信號級聯，AKT可能也涉及Wnt途徑[15，16]。

胰島素與受體結合后，主要通過促進葡萄糖利用、糖原合成、抑制糖異生而實現其降低血糖的作用[17]。而PI3K/AKT通路是胰島素實現其上述作用的主要途徑，激活PI3K信號通路，可激活綁定在磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸上的絲氨酸或蘇氨酸(Ser473、Thr308)兩個主要磷酸化位點，從而激活AKT使其發揮作用[18，19]。本實驗采用Western blot法檢測L6肌細胞中Thr308、Ser473蛋白，同時采用Western blot法檢測CaSR激動劑(GdCl3)對AKT蛋白活性的影響，發現與正常對照組比較，模型對照組蛋白激酶B(AKT)磷酸化(Thr308、Ser473)蛋白表達明顯降低，與模型對照組比較，GdCl3對照組L6肌細胞磷酸化AKT(Thr308 和Ser473)蛋白表達水平明顯升高。實驗結果顯示，L6肌細胞發生IR時，磷酸化AKT蛋白含量明顯下降，AKT活性被抑制，并且CaSR激動劑(GdCl3)可上調AKT活性，提示CaSR可能參與PI3K/AKT信號通路。

花旗澤仁改善IR中藥復方花旗澤仁為臨床治療2型糖尿病IR的有效經驗方，本方基于中醫藥整體觀念和辨證論治的理論，從2型糖尿病IR脾虛濕盛，濕熱內蘊的病理特點出發，以補氣養陰、清火生津之功的西洋參為君藥，滲濕健脾的薏苡仁為臣藥，利水滲濕、泄熱之澤瀉為佐藥，配伍組成花旗澤仁中藥復方，共奏補氣、健脾、生津、清熱、利濕之功[20]。

本課題組前期通過qRT-PCR與Western blot法技術對比檢測2型糖尿病IR大鼠、正常大鼠以及花旗澤仁給藥大鼠的肝臟、脂肪、肌肉及胰腺組織中的CaSR mRNA、蛋白表達和AKT(Thr308 和Ser473)蛋白表達水平的差異，結果表明花旗澤仁具有降血糖、升高胰島素敏感度、上調CaSR mRNA表達、CaSR蛋白表達及AKT(Thr308和Ser473)蛋白表達的作用。

綜上所述，本研究與模型對照組比較，花旗澤仁組L6肌細胞中CaSR mRNA、蛋白及AKT磷酸化(Thr308、Ser473)蛋白表達水平顯著上升，本研究結果表明，花旗澤仁可能通過調節CaSR基因及蛋白的表達，激活AKT的活性，進而調節PI3K/AKT信號通路的轉導，從而改善胰島素抵抗。