miR-630對H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞的增殖、凋亡與氧化損傷的影響

周 洋 陳婷妍 美麗巴努·玉素甫

白內障(cataract)是一種常見的與年齡有關的疾病，其發生率持續上升[1]。由于其發病機制不清楚，因此白內障的非手術治療仍然受到限制。晶狀體上皮細胞是晶狀體中唯一具有分裂活性的細胞，能夠保持晶狀體的滲透壓、維持其內環境的穩定[2]。研究發現，與正常人晶狀體上皮細胞凋亡率比較，白內障患者晶狀體上皮細胞凋亡率明顯增加。體外誘導損傷可以使晶狀體上皮細胞凋亡，從而誘發晶狀體皮質發生混濁，進而導致白內障的形成[3]。氧化損傷可能是白內障發生、發展的關鍵因素[4,5]。研究發現，與年齡相關的白內障患者的晶狀體中活性氧含量(ROS)顯著升高[6]。

H2O2是眾多氧化損傷產物中最重要的物質。目前H2O2誘導的晶狀體上皮細胞凋亡已成為白內障形成的細胞模型被廣泛研究[7]。微小RNA(miRNA)是一類微小的非編碼RNA，通過與其靶標miRNA的3′-非翻譯區(3′-UTR)中的互補序列結合，miRNA可以誘導miRNA降解或翻譯抑制[8]。研究表明，miRNA參與多種生理和病理過程[9]。比如，一些miRNA與年齡相關性白內障的發作有關，這表明miRNA可能成為白內障診斷和治療的新靶點[10]。miR-211在年齡相關性白內障患者的晶狀體中異常表達，可促進晶狀體上皮細胞凋亡[11]。Wang等[12]研究表明，miR-630在白內障患者的晶狀體中表達上調，但是目前 miR-630在白內障中的具體作用和機制還未見相關研究。因此，本研究使用H2O2刺激人晶狀體上皮細胞，體外建立白內障形成模型，探究miR-630對人晶狀體上皮細胞增殖、遷移和氧化損傷的影響，探討其在白內障發病過程中可能的作用和機制，并為miR-630成為白內障靶向治療提供實驗依據。

材料與方法

1.材料：人晶狀體上皮細胞系HLE-B3細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所；DMEM低糖培養基、胎牛血清和CCK-8試劑盒購自美國Gibco公司；H2O2購自美國Sigma公司；TRIzol試劑、cDNA反轉錄試劑盒和SYBR Premix EX TaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒、EdU細胞增殖檢測試劑盒和BCA試劑盒購自英國Abcam公司；陰性對照(miR-NC)、帶熒光標簽GFP的miR-630 inhibitor由Genepharma公司合成；LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；RIPA裂解液和ROS檢測試劑盒購自上海碧云天有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；兔抗Bcl-2抗體、兔抗Akt抗體、山羊抗兔IgG抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

2.細胞培養及分組：HLE-B3細胞用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養基，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養，2天更換一次培養基，以保證細胞所需的營養成分。將細胞分為4組：①對照組：不進行任何處理；②H2O2組：加入H2O2(300μmol/L)進行處理[7]；③H2O2+陰性對照組(H2O2+miR-NC)：轉入陰性對照，并用H2O2(300μmol/L)進行處理；④H2O2+miR-630抑制劑組(H2O2+miR-630 inhibitor組)：轉入miR-630抑制劑，并加入H2O2(300μmol/L)進行處理。

3.細胞轉染與H2O2處理：取處于對數生長期的HLE-B3細胞經消化后，接種到細胞培養皿中，待細胞生長融合至 60%～80%時，按照LipofectamineTM3000轉染試劑說明書將100nmol/L的miR-NC、miR-630 inhibitor分別轉入HLE-B3中。在37℃、5% CO2的培養箱中培養6h后，更換新鮮的培養基繼續培養。48h后，加入H2O2(300μmol/L)培養24h，進行后續實驗。

4.qRT-PCR：用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA。用Nanodrop 2000儀器測量樣品總RNA濃度，并將每個配對的樣品調節至相同濃度。然后按照cDNA反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA。使用SYBR Premix EX TaqTM試劑盒進行qRT-PCR。使用FTC-3000p實時PCR系統完成實驗后，采用2-△△Ct法分析數據。其中使用的引物詳見表1。

5.細胞集落形成實驗：將HLE-B3細胞按照1×106個/孔接種到6孔板中，待細胞融合至60%～80%，按照材料與方法3進行處理。培養72h后，收集各組細胞并接種到60mm的培養皿中。3天更換一次培養基。10天后用結晶紫染色，并計數含有≥50個細胞的集落，并進行拍照。

表1 引物序列

6. EdU實驗：將HLE-B3細胞以1.6×105個細胞/孔的密度接種在96孔板中，待細胞融合至60%～80%，按照材料與方法3進行處理。培養72h后，隨后，向每個孔中加入50mmol/L的5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)，并在37℃下孵育4h。然后將細胞在室溫下用4%多聚甲醛固定15min，并在室溫下用0.5% Triton X-100處理20min以進行透化。將細胞與100ml Apollo混合物在室溫下孵育30min，用100ml Hoechst33342染色30min，并在熒光顯微鏡下成像。使用Image-Pro Plus軟件6.0版來計算EdU陽性細胞(紅色細胞)的數量。EdU摻入效率表示為HLE-B3陽性細胞(藍色細胞)中EdU陽性細胞的比例。

7.細胞劃痕愈合實驗：HLE-B3細胞分別制成單細胞懸液，然后細胞按照1×105個/孔接種在6孔板中，置于37℃、5% CO2的培養箱中孵育。細胞生長融合至60%～80%時，按材料與方法3進行處理。待各組細胞長滿后，用200μl無菌移液管在細胞單層做線性劃痕，立即在熒光倒置顯微鏡下進行拍照，并在48h后觀察遷移的距離。使用Image J軟件測量各組細胞遷移的距離。

8.流式細胞術：收集轉染并處理后的各組細胞，離心并重懸于緩沖液中。將細胞依次用異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)溶液(10μl)和碘化丙啶(PI)溶液(10μl)染色。將染色的細胞在室溫下黑暗中孵育30min，然后使用FACSCaliburTM流式細胞儀進行分析。

9.ROS水平和SOD的含量測定：(1)ROS水平測定：用無血清的DMEM低糖培養基稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μmol/L。用稀釋好的DCFH-DA溶液重懸各組細胞，使細胞密度為1×106個/毫升，在37℃、5% CO2的培養箱中孵育20min。用無血清的DMEM低糖培養基洗滌細胞3次，然后使用熒光酶標儀檢測熒光強度，激發波長和發射波長分別為488nm和525nm。(2)SOD含量測定：各組細胞按材料與方法3處理，72h后用移液槍吸出細胞上清液，并用預冷的PBS洗滌細胞2次，然后嚴格按照試劑盒說明書要求進行后續實驗，最后用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度值。

10.Western blot法：轉染并處理后的各組細胞用RIPA裂解提取總蛋白，并通過BCA方法進行定量，樣品經變性后進行上樣。按照實驗步驟進行電泳-轉膜-封閉(5%脫脂奶粉)-一抗孵育[兔抗Bcl-2 抗體(1∶1000)、兔抗Akt抗體(1∶1000)，4℃過夜]-二抗孵育[山羊抗兔IgG抗體(1∶2000)，室溫1h]-顯影曝光。Image-Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶進行分析。

結 果

1.miR-630在HLE-B3細胞中的表達：在miR-NC及miR-630 inhibitor轉染入HLE-B3細胞48h后，熒光檢測結果顯示轉染了miR-630 inhibitor的HLE-B3細胞中可見攜帶GFP綠色熒光蛋白，表明轉染成功(圖1A)。各組細胞培養72h后，提取其總miRNA進行qRT-PCR驗證，與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組HLE-B3細胞中miR-630的表達水平上調(P均=0.000)，H2O2+miR-630 inhibitor組HLE-B3細胞中的miR-630表達水平明顯下調(P<0.01)；與H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組HLE-B3細胞中的miR-630表達水平明顯下調(P均=0.000，圖1B)；H2O2組和H2O2+miR-NC組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.miR-630對HLE-B3細胞形態的影響：與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組HLE-B3細胞表現出棒狀或長紡錘形形態，細胞與細胞之間的接觸失調，細胞散布排列；與H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組HLE-B3細胞具有上皮特征，呈立方狀且規則排列，細胞排列相對緊密(圖2)。

圖1 miR-630在HLE-B3細胞中的表達情況A.鏡下觀察綠色熒光蛋白表達的情況(×200)；B.qRT-PCR檢測miR-630在HLE-B3細胞中的表達情況；與對照組比較，*P<0.01，**P=0.000；與H2O2組比較，#P=0.000；與H2O2+miR-NC組比較，ΔP=0.000

圖2 miR-630對HLE-B3細胞形態的影響(×200)

3.miR-630對HLE-B3細胞增殖能力的影響：細胞集落形成實驗表明(圖3A)，與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組HLE-B3細胞的增殖能力顯著下降(P均=0.000)； 與H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組HLE-B3細胞的增殖能力明顯提高(P均<0.01)；H2O2組和H2O2+miR-NC組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。EdU實驗結果表明(圖3B)，與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組中的EdU陽性細胞數顯著減少(P均=0.000)；與H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組中的EdU陽性細胞數明顯增加(P均<0.01)；H2O2組和H2O2+miR-NC組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖3 miR-630對HLE-B3細胞增殖的影響A.細胞集落形成實驗檢測HLE-B3細胞的增殖情況；B.EdU分析HLE-B3細胞的增殖情況；與對照組比較，*P<0.05，**P=0.000；與H2O2組比較，#P<0.01；與H2O2+miR-NC組比較，ΔP<0.01

4.miR-630對HLE-B3細胞遷移的影響：細胞劃痕愈合實驗表明，與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組HLE-B3細胞的遷移能力顯著下降(P均=0.000)；與H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組HLE-B3細胞的遷移能力提高(P均<0.05)；H2O2組和H2O2+miR-NC組之間比較差異無統計學意義(P>0.05，圖4)。

圖4 miR-630對HLE-3細胞遷移的影響與對照組比較，*P<0.01，**P=0.000；與H2O2組比較，#P<0.05；與H2O2+miR-NC組比較，ΔP<0.05

5.miR-630對HLE-B3細胞凋亡的影響：流式細胞術結果表明，與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組HLE-B3細胞的凋亡能力顯著提高(P均=0.000)；與H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組HLE-B3細胞的凋亡能力顯著下降(P均=0.000)；H2O2組和H2O2+miR-NC組之間比較差異無統計學意義(P>0.05，圖5)。

6.miR-630對HLE-B3細胞中ROS水平和SOD含量的影響：與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組中ROS水平上調(P均=0.000)，SOD含量減少(P=0.000)；與 H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組中ROS水平下調(P均<0.01)，SOD含量增加(P<0.05)；H2O2組和H2O2+miR-NC組中兩者變化均不大，差異均無統計學意義(P>0.05，圖6)。

圖5 miR-630對HLE-3細胞凋亡的影響與對照組比較，*P=0.000；與H2O2組比較，#P=0.000；與H2O2+miR-NC組比較，ΔP=0.000

圖6 miR-630對HLE-B3細胞中ROS水平和SOD含量的影響A.miR-630對HLE-B3細胞中ROS水平的影響;B.miR-630對HLE-B3細胞中SOD含量的影響;與對照組比較，*P=0.000；與H2O2組比較，#P<0.05,##P<0.01；與H2O2+miR-NC組比較，ΔP<0.05,ΔΔP<0.01

7.miR-630對HLE-B3細胞中Bcl-2和Akt蛋白表達的影響：Western blot法結果表明，與對照組比較，H2O2組和H2O2+miR-NC組中Bcl-2和Akt蛋白表達水平下調(P均=0.000)；與 H2O2組和H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-630 inhibitor組中Bcl-2和Akt蛋白表達水平上調(P<0.01，P<0.05)；H2O2組和H2O2+miR-NC組中兩者變化均不大，差異均無統計學意義(P>0.05，圖7)。

討 論

白內障是最常見的眼科疾病之一，也是視力障礙或視力喪失的主要原因之一[13]。目前對該病的治療幾乎完全是外科手術，白內障手術是對65歲以上的患者進行的最常見的外科手術[14]。手術治療雖然有效，但通常花費較大，并給患者帶來恐懼[15]。因此，對白內障的有效非手術干預進行研究是一項重要嘗試，具有廣泛的應用前景和社會效益。

圖7 miR-630 對HLE-B3細胞中Bcl-2和Akt蛋白表達的影響與對照組比較，*P<0.05，**P=0.000；與H2O2組比較，#P<0.05，##P<0.01；與H2O2+miR-NC組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

miRNA是一類小的非編碼RNA，具有至關重要的基因調節功能，該功能通過與靶基因的3′-非翻譯區(3′UTR)結合而起作用[16]。越來越多的證據表明，miRNA在哺乳動物晶狀體的多個病理過程中起關鍵作用[17]。研究表明，miR-26、miR-30a和miR-211通過靶向某些mRNA參與白內障的形成[18～20]。有文獻報道，miR-630在白內障患者的晶狀體中表達上調，但是miR-630在白內障中的具體作用和機制還未見相關研究[12]。本研究發現，H2O2刺激誘導HLE-B3細胞時，使HLE-B3細胞中miR-630的表達上調，這與miR-630在白內障患者晶狀體中的表達結果相一致。

在白內障的形成過程中，晶狀體上皮細胞會發生大量凋亡，并且有研究表明，H2O2誘導的氧化損傷能引起晶狀體上皮細胞凋亡[21]。本研究通過給予HLE-B3細胞轉染miR-630 inhibitor使miR-630低表達，來探究miR-630對晶狀體上皮細胞增殖、遷移、凋亡的影響。結果表明，與 H2O2組和H2O2+miR-NC比較，低表達miR-630增加了HLE-B3細胞的增殖能力、遷移能力，降低了HLE-B3細胞的凋亡率。研究報道，多種刺激物可能在眼中產生氧自由基，并且所產生的氧化應激在白內障的發病機制中起著重要作用[22]。

氧化應激代表氧化劑和抗氧化劑之間的平衡發生轉移，從而導致組織中的ROS增加。ROS表達增加通常與病理相關，并與引起細胞衰老、凋亡和壞死有關[23]。研究發現，白內障患者晶狀體中的ROS水平顯著上調[6]。SOD是生物體內重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內，如動物、植物、微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內清除自由基的首要物質。它可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞。本研究發現，下調 miR-630表達能夠降低H2O2誘導的細胞內 ROS水平，增加SOD的含量。結果表明，下調miR-630表達可能減少H2O2誘導的晶狀體上皮細胞氧化損傷。Bcl-2和Akt是重要的抗凋亡基因，通過抑制超氧陰離子的過多產生或抑制線粒體通透性的改變，阻止線粒體膜轉膜電位的下降，從而抑制細胞凋亡[24]。因此，本研究探究了H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞中miR-630與Bcl-2和Akt的關系。結果表明，在人晶狀體上皮細胞中，低表達miR-630能夠上調H2O2誘導的Bcl-2和Akt的表達。

綜上所述，低表達miR-630可能增加H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞的增殖、遷移，抑制其凋亡與氧化損傷，其可能與Bcl-2和Akt的表達上調相關。因此，miR-630可能是治療白內障的潛在靶點。