潰瘍性結腸炎患者中誘騙受體和護骨素基因多態性及其結腸組織表達水平分析

邵曉曉 金穎莉 林芊如 閔全佳 朱浩奇 蔣 益

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性腸道炎癥，主要累及結腸黏膜和黏膜下層，范圍多自遠端結腸開始，可逆行向近端發展，甚至累及全結腸及末端回腸，病灶多呈連續性分布。流行病學數據顯示，UC的全球發生率不斷升高，我國亦是逐年增加[1]。UC的確切病因和發生機制至今尚未闡明，而且由于缺少特異性的治療手段和藥物，UC患者的病情常遷延、反復，不僅嚴重影響患者的生活質量，也給家庭和社會帶來沉重的負擔。

細胞凋亡(apoptosis)是調控機體正常發育、維護內環境穩定的重要生理過程，研究證實細胞凋亡失調在UC的發病中占有十分重要的地位，腸黏膜上皮細胞凋亡過度，黏膜固有層淋巴細胞(LPT)凋亡抵抗和凋亡遲滯，是導致腸組織炎性反應發生和持續的重要原因[2]。研究發現在UC炎癥局部及其鄰近區域，整個結腸隱窩上皮細胞均有凋亡現象。用多種凋亡標志物檢測UC和正常結腸上皮細胞凋亡的程度和范圍，發現活動性UC病變區域上皮細胞凋亡發生的程度和范圍都高于正常組織[3]。

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor related apoptosis- inducing ligand, TRAIL) 能激活外源性凋亡途徑，促進細胞凋亡。研究證實TRAIL與類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)、多發性硬化癥(multiple sclerosis, MS)、系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)、自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis, AIT)等疾病相關[4～7]。TRAIL主要通過與死亡受體(death receptor, DR)4或DR5結合，產生促細胞凋亡信號，誘導靶細胞凋亡。除DR4、DR5外，TRAIL受體家族還包括誘騙受體(decoy receptor, DcR)1、DcR2及護骨素(osteoprotegerin, OPG)。TRAIL與死亡受體結合，通過天冬氨酸蛋白水解酶-8(cysteinyl aspartate specific proteinase-8, caspase-8)和Fas相關死亡結構域(Fas-associated death domain, FADD)途徑轉導凋亡信號，但DcR1缺乏跨膜區及胞內域，DcR2僅含有截斷的死亡結構域，OPG缺乏功能性的死亡結構域，因此這3種受體與TRAIL結合后不僅不產生細胞凋亡信號，還與DR4或DR5競爭性結合TRAIL，抑制靶細胞凋亡。

本研究組前期初步探討了TRAIL基因3′非翻譯端 (G1525A、G1588A、C1595T)3個SNPs和血漿sTRAIL水平以及死亡受體DR4、DR5基因多態性與中國漢族人群UC易感性的關系，結果發現UC患者中TRAIL(G1525A、G1588A、C1595T)位點的突變率明顯高于對照組，提示這3個SNP的突變對UC具有保護作用，可能是影響UC易感性的潛在功能性位點[8]。進一步研究發現DcR2(rs1133782位點)基因多態性可能影響UC的易感性，OPG(rs3102735)基因突變不僅會增加UC的患病風險，還可能影響UC的疾病嚴重程度[9]。但由于TRAIL的生物學效應受多種因素的影響，尤其是與TRAIL受體家族的表達或功能密不可分，因此本研究將進一步探討結腸組織中DcR1、DcR2和OPG的表達水平與UC的關系，旨在為揭示UC的遺傳免疫學機制提供線索。

對象與方法

1.研究對象:收集2018年3月～2019年4月溫州醫科大學附屬第二醫院消化住院和門診確診的UC患者56例，其中男性26例，女性30例，患者平均年齡38.42±15.24歲。同期于溫州醫科大學附屬第二醫院消化內科收集的性別、年齡相匹配的良性結腸息肉患者62例(男性30例，女性32例)，患者平均年齡37.56±16.36歲。依據中華醫學會消化病分會制定的“炎癥性腸病診斷與治療的共識意見”[10]，經臨床、實驗室、胃鏡、結腸鏡、小腸鏡或膠囊內鏡、放射影像學及病理組織學等檢查綜合確立UC診斷，所有納入研究的病例均為初發型UC。依據結腸鏡表現將UC疾病部位分為遠端結腸炎 (E1+E2，31例) 和廣泛結腸炎 (E3，25例)。依據“改良的Truelove & Witts評分”將UC疾病嚴重程度分為輕度(23例)、中度(28例)和重度(5例)[11]。所有UC病例納入前經各項檢查排除感染性腹瀉、缺血性腸病、放射性腸炎、消化道腫瘤、糖尿病、系統性紅斑狼瘡、自身免疫性甲狀腺炎等疾病。以上研究對象均來自無血緣關系的浙江漢族人群，所有入選者均簽署知情同意書，本研究獲得溫州醫科大學附屬第二醫院醫學倫理學委員會批準。

2.RT-qPCR檢測結腸組織中DcR1、DcR2和OPG的表達水平：(1) 標本采集：56例UC患者和62例性別、年齡相匹配的良性結腸息肉患者均采用結腸鏡活檢鉗留取乙狀結腸部位 (距肛緣30cm) 的黏膜組織，大小約2mm×2mm×2塊，一部分置于-80℃凍存備用，另一部分用4%多聚甲醛固定保存，石蠟包埋后以4～5μm厚度連續病理切片。(2) RT-qPCR檢測：采用TRIzol試劑 (美國Invitrogen公司)，按照試劑盒說明書，在嚴格無菌條件下提取結腸組織總RNA。NanoDrop-2000分光光度計(美國Thermo公司)檢測RNA純度和濃度。使用反轉錄試劑盒 (美國Applied Biosystems公司) 合成cDNA，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列如下：β-actin上游引物：5′-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3′，下游引物：5′-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3′；DcR1上游引物：5′-GTGGTTCGTTTTGATTTGCCC-3′，下游引物：5′-CGTGTTGATTGTGACTCGTGGA-3′；DcR2上游引物：5′-AACATGGTCCTGCTTGTGACG-3′，下游引物：5′-ATCTGCGGTCTCACTGGTCTG-3′；OPG上游引物：5′-CCTGGATTTGGAGTGGTGCAA-3′，下游引物：5′-AATGCCTCCTCACACAGGGTA-3′；以cDNA為模板，嚴格按照RT-qPCR試劑盒(美國Applied Biosystems公司)說明書進行實驗操作，25μl反應體系中含cDNA 2.5μl，上下游引物各1.0μl，2×real time RT-PCR Mix 12.5μl和適量去離子水。反應程序：95℃預變性10min，95℃ 15s，60℃ 1min，共40個循環。采用2-△△CT法計算mRNA相對表達量。

3.免疫組織化學法檢測結腸組織中DcR1、DcR2和OPG蛋白表達水平：主要試劑包括鼠抗人DcR1、DcR2、OPG抗體 (英國Abcam公司)，抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒 (丹麥Dako Denmark A/S公司)。石蠟切片置于65℃烘箱中烘片2h，然后二甲苯脫蠟，經梯度乙醇水化，切片PBS浸泡后，用PBS沖洗3次，每次5min。切片置于pH 6.0檸檬酸緩沖液中微波修復，微波爐中火至沸后斷電，間隔10min低火至沸。自然冷卻后用PBS洗3次，每次5min。切片放入3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶。PBS洗3次，每次5min，甩干后用5%牛血清白蛋白 (BSA) (瑞士羅氏公司) 室溫20min封閉非特異性反應位點。每張切片加入50μl 200倍稀釋的鼠抗人DcR1、DcR2、OPG抗體 (英國Abcam公司) 覆蓋組織，4℃過夜。PBS洗3次，每次5min。去除PBS液，每張切片加50～100μl的抗兔/鼠通用型免疫組化二抗 (丹麥Dako Denmark A/S公司)，4℃孵育50min。PBS洗3次，每次5min。去除PBS，每張切片加50～100μl新鮮配制二氨基聯苯胺 (DAB) 溶液，顯微鏡下控制顯色時間。顯色完全后，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，1%鹽酸乙醇分化 (1s)，蒸餾水沖洗，1%氨水(NH3·H2O) 返藍，自來水沖洗。最后切片經過梯度乙醇(70%～90%～95%～100%)各10min，脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。免疫組化結果判定以細胞質或細胞核中出現棕黃色為陽性。在200倍鏡下每張切片隨機選取5個視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件 (美國Media Cybernetics公司) 分析每張圖片中陽性染色部分的平均光密度 (IOD/Area) 值，取均值表示DcR1、DcR2、OPG蛋白表達水平。

結 果

1.DcR1、DcR2、OPG基因多態性與UC易感性的關系:UC組和對照組中，DcR1 (rs12549481)、DcR2 (rs1133782)和OPG (rs3102735) 的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(UC組：P=0.543，0.763，0.845；對照組：P=0.666，0.587，0.582)。非條件Logistic回歸分析發現，與對照組比較，UC組中DcR2 (rs1133782)的突變等位基因(A)和基因型(GA+AA)頻率均顯著增高(15.18% vs 6.45%，OR=2.595，95%CI：1.073～6.274，P=0.030；28.57% vs 12.90%，OR=2.700，95%CI：1.053～6.926，P=0.035，表1)。而其他兩個SNP的突變等位基因和基因型頻率在UC組和對照組之間比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)。

2.UC組和對照組的結腸組織中DcR1、DcR2、OPG mRNA表達水平比較:UC患者結腸組織中DcR2 mRNA表達水平顯著低于對照組(4.49±2.29 vs 9.49±4.06，t=8.134，P<0.01)。56例UC患者中，攜帶DcR2(rs1133782)(GG)基因型40例，(GA)基因型15例，(AA)基因型1例。與攜帶DcR2(rs1133782)基因型 (GG) 的UC患者比較，攜帶DcR2 (rs1133782)(GA+AA)基因型的患者結腸組織中DcR2 mRNA表達水平顯著降低(3.64±1.63 vs 6.62±2.35，t=5.43，P<0.01)。而UC組中，DcR1 (rs12549481)和OPG (rs3102735)不同基因型攜帶者之間DcR1、OPG mRNA表達水平比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)。

3.UC組和對照組的結腸組織中DcR1、DcR2、OPG蛋白表達水平比較：UC組結腸組織中DcR2蛋白表達水平顯著低于對照組(0.180±0.052 vs 0.273±0.069，t=8.322，P<0.01，圖1)。UC患者中，與攜帶DcR2 (rs1133782)(GG)基因型的患者比較，攜帶DcR2 (rs1133782)(GA+AA)基因型的患者結腸組織中DcR2蛋白表達水平也顯著降低(0.129±0.028 vs 0.198±0.047，t=7.147，P<0.01，圖2)。而UC組中，DcR1和OPG的不同基因型攜帶者之間蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)。

表1 潰瘍性結腸炎(UC)組和對照組DcR1、DcR2、OPG基因多態性分布差異[n(%)]

圖1 兩組結腸組織中DcR2蛋白的染色結果(HE,×400)A.對照組;B.UC患者

圖2 UC患者結腸組織中DcR2蛋白的染色結果(HE,×400)A.基因型GG;B.基因型GA+AA

討 論

人類DcR1、DcR2基因均定位于8號染色體短臂2區1～2帶。DcR1 (rs12549481)位于啟動子上游第376個堿基位點，當該位點野生型等位基因(T)突變為(C)后可能在轉錄水平影響DcR1蛋白表達水平[11,12]。DcR2 (rs1133782)位于第7外顯子，此SNP的等位基因(G)突變為(A)時，可以使正常的亮氨酸突變為絲氨酸，從而導致DcR2蛋白質空間構象和生理功能發生異常[13]。OPG基因位于染色體8號染色體長臂2區4帶，OPG (rs3102735)位于啟動子上游第759個堿基位點，此等位基因(C)突變為(T)時可能影響OPG的蛋白質表達水平[14]。理論上，TRAIL凋亡信號主要受TRAIL及其受體的影響。

筆者前期研究發現，DcR2 (rs1133782)基因多態性可能影響UC的易感性，OPG (rs3102735)基因突變不僅會增加UC的患病風險，還可能影響UC的疾病嚴重程度。本研究也證實DcR2(rs1133782)突變可能增加UC的發病風險，但因為樣本量所限，故未進行進一步分層分析。近年來，DcR1、DcR2和OPG基因多態性及其表達水平與多種腫瘤及自身免疫性疾病的相關性研究備受研究者的關注。Riccioni等[11]發現急性髓性白血病中DcR1、DcR2的表達水平增高，并與該病病程顯著相關。有研究報道，DcR1 (rs12549481)基因多態性與韓國人群早期非小細胞肺癌的發病無顯著相關性[15]。另有研究顯示，DcR1 (rs12549481)基因多態性與中國漢族人群 T細胞淋巴瘤發病風險亦無顯著關聯[16]。Ulybina等[17]研究報道，DcR2 (rs1133782)基因多態性與俄羅斯人群肺癌的發病風險無明顯關聯。還有研究顯示DcR2 (rs1133782)基因多態性與中國漢族人群的T細胞淋巴瘤的發病風險無顯著相關性[16]。此外，有研究者對法國前列癌患者的研究顯示DcR2水平下調能提高前列腺癌中LNCaP細胞對TRAIL誘導的細胞凋亡的敏感度，提示DcR2可能與前列腺癌的發病有關[12]。

Büneker等[13]研究認為DR4/(DcR1+DcR2)之比可作為預測腫瘤細胞是否對TRAIL誘導的凋亡反應敏感的指標。Liu等[14]研究發現DcR2是p53的靶基因之一，受內源性p53結合位點的調控，并且DcR2還能調節患者對化療藥物的敏感度。另有研究報道DcR1、DcR2對死亡受體的影響存在差異，DcR2優先抑制DR5誘導的凋亡反應，提示在誘騙受體中，DcR2可能較DcR1的作用更為重要[18]。Christoph等[19]研究發現，OPG mRNA表達水平與前列腺癌患者癌細胞擴散相關。另有研究發現CD8+T細胞表面DcR1和DcR2的表達水平與RA的嚴重程度相關。Ney等[20]在高加索人群中發現攜帶OPG (rs3102735)等位基因(C)發生乳腺癌的風險性將增加1.5倍。對自身免疫性甲亢的研究顯示，OPG (rs3102735)基因多態性與患者的骨密度相關，該位點等位基因(C)的攜帶者，其遠端脛骨發生骨密度降低的風險性可能增加。Assmann等[21]研究報道OPG(rs3102735)基因多態性與德國人群RA的易感性無關。另有研究顯示,OPG(rs3102735)基因多態性可能不影響銀屑病的易感性。

本研究采用RT-qPCR和免疫組化法檢測結腸組織中DcR1、DcR2、OPG mRNA和蛋白水平，結果發現與良性結腸息肉對照組比較，UC患者結腸組織中DcR2 mRNA和蛋白表達水平均顯著降低。本研究還在攜帶不同基因型的UC患者之間，進一步分析比較結腸組織中DcR1、DcR2、OPG mRNA和蛋白表達水平是否存在差異。結果發現與攜帶DcR2(rs1133782) (GG)基因型的UC患者比較，攜帶(GA+AA)基因型的UC患者結腸組織中DcR2 mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，但對照組和UC患者之間以及攜帶不同基因型的UC患者之間DcR1、OPG mRNA及蛋白表達水平比較差異均無統計學意義。上述研究結果提示，DcR2 (rs1133782)基因突變可能降低UC的發病風險，機制可能通過降低DcR2 mRNA和蛋白表達水平發揮作用，DcR1 (rs12549481)和OPG (rs3102735) 基因多態性及其腸組織表達水平與UC的發病風險無顯著關聯。而DcR1和DcR2抑制TRAIL凋亡機制的差異充分表明TRAIL凋亡信號的調節機制及影響因素相當復雜。綜合上述研究結果，筆者推測在UC病程中DcR2對TRAIL凋亡信號的抑制作用可能比DcR1更為重要，DcR2 (rs1133782)可能是影響UC易感性的潛在功能性位點，突變后可能造成DcR2蛋白的空間結構和功能發生異常，使DcR2對TRAIL凋亡信號的抑制效應降低，進而影響UC的發病風險。OPG屬分泌型糖蛋白，是一種可溶性游離受體，在體內主要發揮抑制破骨細胞發生和增加骨密度的作用。在正常生理狀態下，與TRAIL的其他受體比較，OPG與TRAIL的親和力最弱，所誘導的凋亡抑制作用也顯著弱于DcR1和DcR2[22]。

綜上所述，本研究發現DcR2 (rs1133782)基因突變可能降低UC的發病風險，機制可能通過降低DcR2 mRNA和蛋白表達水平發揮作用，DcR1 (rs12549481)和OPG (rs3102735) 基因多態性及其結腸組織表達水平與UC的發病風險無顯著關聯。但由于TRAIL誘導凋亡的機制紛繁復雜，本研究尚無法闡明DcR2 (rs1133782)影響UC發病的具體機制，有待于后續研究進一步探討和論證。